手機(jī)微波輻射對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞影響的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、白內(nèi)障是人類嚴(yán)重的致盲眼病之一，在我國已列為致盲性眼病的首位。先天遺傳、年齡、青光眼、葡萄膜炎、代謝性疾病、藥物中毒和眼外傷等等是最常見的發(fā)病因素。近來，一個(gè)曾經(jīng)被忽視的影響因素愈來愈受到人們的重視，那就是各種電磁波輻射。目前，電磁波中微波對(duì)晶狀體造成損傷的機(jī)制，以及引發(fā)白內(nèi)障的病理過程是研究和討論的重點(diǎn)之一，也是爭論的焦點(diǎn)。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)度高于10mW/cm2的微波輻射就足以引起晶狀體內(nèi)部水溶性蛋白質(zhì)比率的改變。 蛋白質(zhì)

2、組學(xué)(Proteomics)是后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。它是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動(dòng)規(guī)律。目前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用到生命科學(xué)的基礎(chǔ)學(xué)科中，但對(duì)人體某一特定細(xì)胞或組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的報(bào)道仍然很少。如果能從人類晶狀體上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)組中篩選出與白內(nèi)障發(fā)生密切相關(guān)的標(biāo)志性蛋白，將對(duì)白內(nèi)障的機(jī)理性研

3、究產(chǎn)生突破性的推動(dòng)作用。 本研究首先對(duì)傳統(tǒng)的雙向電泳方法進(jìn)行了優(yōu)化，以雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜分析的方法，對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)組譜的表達(dá)進(jìn)行探索，以期建立人晶狀體疾病蛋白質(zhì)組學(xué)的研究途徑。 在接下來的研究中，我們運(yùn)用建立起的蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，分析1.8GMHz微波輻射對(duì)體外培養(yǎng)的人類晶狀體上皮細(xì)胞的影響。 第一部份人晶狀體上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)體系的建立 [目的]建立人晶狀體上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究體系，

4、探討雙向電泳和質(zhì)譜鑒定技在人晶狀體上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的作用。 [方法]體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞株，用兩種不同方法提取總蛋白，進(jìn)行固相pH梯度(IPG)等電聚焦雙向凝膠電泳，銀染顯色的凝膠通過GS-800掃描儀(Bio-Rad)獲取圖像，使用PDQuest專業(yè)圖像分析軟件分析電泳圖像，尋找并分析差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。在此基礎(chǔ)之上，采用自動(dòng)凝膠采樣系統(tǒng)采集蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，然后用特異性的胰酶消化蛋白質(zhì)，酶解后的肽段采用LCQDecaXP型

5、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。 [結(jié)果]獲得了重復(fù)性較好的人晶狀體上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)組電泳圖譜。晶狀體蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在等電點(diǎn)PH值為4～7、相對(duì)分子質(zhì)量為17kD～72kD之間均有分布。其中高豐度蛋白質(zhì)斑點(diǎn)主要分布于分子量19kD～50kD、PI5～7范圍內(nèi)。2個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)通過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫的檢索得到了初步的鑒定。 [結(jié)論]建立起了一個(gè)穩(wěn)定的分析人晶狀體上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)體系；為進(jìn)一步研究人類晶狀體在生理狀態(tài)及白內(nèi)

6、障等病理狀態(tài)下的改變提供了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法和途徑。 第二部分用雙向電泳及質(zhì)譜分析方法研究手機(jī)微波對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞影響 [目的]用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究GSM制式1.8GHz微波輻射對(duì)體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞的影響。 [方法]體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞株，隨機(jī)分組，分別用SAR值為1.0、2.0和3.5W/kg的1.8GHzGSM制式微波輻照2小時(shí)，并設(shè)對(duì)照組。輻照后立即提取總蛋白，用固相pH梯度(IPG)等電聚焦

7、雙向凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，銀染顯色的凝膠通過GS-800掃描儀(Bio-Rad)獲取圖像，使用PDQuest專業(yè)圖像分析軟件分析電泳圖像。對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)用自動(dòng)凝膠采樣系統(tǒng)采集，然后用特異性的胰酶消化蛋白質(zhì)，酶解后的肽段采用LCQDecaXP型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。用半定量RT-PCR、westernblot對(duì)HSP70進(jìn)行反饋性驗(yàn)證。 [結(jié)果]比較輻照組及假照組細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜，SAR值為1.0未發(fā)

8、現(xiàn)差異點(diǎn)、2.0和3.5W/kg共獲得7個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。5個(gè)點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)庫查詢，獲得初步鑒定。其中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)HSP-70和hnRNPK在輻照后的表達(dá)是上調(diào)的。RT-PCR及westernblot進(jìn)一步驗(yàn)證了雙向凝膠電泳及質(zhì)譜鑒定的結(jié)果。 [結(jié)論]雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜分析是篩選人晶狀體上皮細(xì)胞電磁效應(yīng)異常表達(dá)蛋白質(zhì)的有效手段。HSP-70和hnRNPK有可能參與了微波輻照所致人晶狀體上皮細(xì)胞非熱效應(yīng)的應(yīng)激過程。