AKT蛋白激酶調(diào)控人類晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的功能初探.pdf

1、晶體后囊膜混濁（Posterior Capsular Opacification，PCO）是人工晶體植入術(shù)后導(dǎo)致視力下降甚至失明的最普遍并發(fā)癥。白內(nèi)障手術(shù)殘留的晶狀體上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是PCO病理過程中至關(guān)重要的分子事件，對晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的調(diào)控機(jī)制研究可為PCO臨床藥物的選擇和研發(fā)提供新的切入點(diǎn)。
　　AKT屬于蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶家族，包含

2、三個獨(dú)立基因編碼的異構(gòu)體:AKT1、AKT2和AKT3，它們具有相似的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，以AKT1為例，氨基末端是PH結(jié)構(gòu)域，中間是催化結(jié)構(gòu)域，含有FPQFSY疏水基序的羧基末端，催化結(jié)構(gòu)域中蘇氨酸殘基(Thr308)和疏水基序中絲氨酸殘基(Ser473)的磷酸化修飾是激活A(yù)KT1的必要條件。盡管有研究指出PI3K/AKT信號通路與晶狀體上皮細(xì)胞EMT的關(guān)聯(lián)性，但AKT異構(gòu)體是否均參與調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞EMT，以及其調(diào)控EMT過程中基因表

3、達(dá)改變的機(jī)制仍未被闡明。
　　本實驗室之前研究發(fā)現(xiàn)AKT1和AKT2在小鼠晶狀體上皮組織中呈現(xiàn)主導(dǎo)性表達(dá)。為探索AKT1和AKT2調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞EMT的分子機(jī)制，我們建立了TGFβ1誘導(dǎo)的人類晶狀體上皮(Human LensEpithelium，HLE)細(xì)胞發(fā)生EMT的模型。當(dāng)利用PI3K化學(xué)抑制劑LY294002抑制HLE細(xì)胞中內(nèi)源性AKT蛋白激酶的激活時，TGFβ1誘導(dǎo)的EMT標(biāo)志性基因Fibronectin等和轉(zhuǎn)錄因子S

4、NAIL1的表達(dá)上調(diào)被顯著削弱;進(jìn)一步用特異性shRNA敲低AKT1以及AKT2所建立的穩(wěn)定HLE細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)AKT1和AKT2敲低能顯著削弱TGFβ1誘導(dǎo)的Fibronectin和SNAIL1的表達(dá)上調(diào);最后我們構(gòu)建了AKT1和AKT2重組表達(dá)質(zhì)粒，并利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了顯性負(fù)性突變的突變體質(zhì)粒: AKT1-T308A/S473A和AKT2-T309A/S474A。與轉(zhuǎn)染空載體的HLE細(xì)胞相比較，過表達(dá)野生型AKT1或者AKT2的

5、HLE細(xì)胞能夠顯著增加TGFβ1誘導(dǎo)的Fibronectin和SNAIL1的表達(dá)水平;但顯性負(fù)性突變的質(zhì)粒的過表達(dá)并不能顯著增加TGFβ1誘導(dǎo)的Fibronectin和SNAIL1的表達(dá)水平。綜上所述，我們證實AKT蛋白激酶異構(gòu)體AKT1和AKT2能促進(jìn)HLE細(xì)胞的EMT。
　　我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)GSK3β并非AKT1和AKT2促進(jìn)HLE細(xì)胞EMT的主要下游靶分子，我們正在深入研究可能的靶分子及其機(jī)制。我們的實驗充分確定了AKT1和A