胸腺素α1的生物合成及抗腫瘤機理研究.pdf

1、人胸腺素α1(Tα1)是一種28個氨基酸組成的具有免疫增強作用的生物活性多肽，其具有廣泛的生物學功能，如免疫調節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、內分泌調節(jié)等。目前Tα1被廣泛應用于慢性病毒性肝炎、細菌或真菌感染、免疫缺陷以及腫瘤等疾病的治療，具有重大的經濟效益與社會價值，因此Tα1的功能研究與生產制備的探索都具有重要意義。本文將Tα1基因轉入大腸桿菌中表達并進行化學修飾，同時研究其對腫瘤細胞的周期阻滯作用。
　　 本實驗首先以實驗室保存的核酸

2、片段為模板，人工合成了Tα1的核酸序列，將其與pTWINⅠ質粒中的內含肽自剪切序列(Ssp)相連，通過EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切與pET-32a質粒連接，成功構建了大腸桿菌表達載體pET-32a-Ssp-Tα1，并轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株從而獲得有效表達(目的蛋白占總蛋白50％以上)。我們通過一系列實驗確認目的蛋白主要以可溶形式存在于菌體內，優(yōu)化了表達條件(37℃，IPTG終濃度0.5 mM)，并通過細胞破碎、收集離心上清、分

3、子篩層析與Ni+親和層析等過程純化了重組蛋白。然后改變環(huán)境pH以誘導融合蛋白發(fā)生內切割，收集得到了N端無乙酰的Tα1單體，酸性環(huán)境下(pH3-4)使用醋酸酐對其進行體外乙?；瘡亩玫搅送暾Y構的Tα1多肽，并對其進行HPLC純化與質譜分析，驗證了其分子量(3108 Da)。另外本實驗通過western-blot，研究了Tα1作用下HepG-2細胞內部分細胞周期調控因子的表達水平變化，發(fā)現(xiàn)Tα1能夠誘導腫瘤細胞內Akt信號通路的阻滯和p5

4、3通路的激活，在降低cyclins與CDKs的表達水平的同時促進CDKI的表達，進而阻滯細胞周期于G1期。
　　 本實驗在大腸桿菌表達系統(tǒng)中有效表達Tα1融合蛋白后，又通過內含肽誘導的蛋白自剪切技術得到Tα1單體，簡化了Tα1的生產工藝并有望降低其成本，為大量生產Tα1滿足臨床需求開辟了新途徑。同時發(fā)現(xiàn)Tα1能通過調控細胞周期調控因子的表達水平來阻滯腫瘤細胞的生長周期，為進一步研究Tα1的生物功能提供了新的思路，也為Tα1臨床應