p38和JNK在缺氧誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、研究背景：缺血缺氧是眾多視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病的關(guān)鍵始發(fā)因素。缺氧不僅誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞的增生，而且通過影響相關(guān)細(xì)胞因子(如VEGF、PEDF等)的分泌水平間接參與了眼底新生血管性疾病的發(fā)生發(fā)展。近十年來，缺氧下RPE細(xì)胞的相關(guān)研究已逐步成為學(xué)術(shù)界熱點(diǎn)之一。有研究表明，在多種眼底疾病中(年齡相關(guān)性黃斑變性(age related macular degeneration,AM

2、D)、遺傳性外層視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良和增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)等)均可觀察到RPE細(xì)胞凋亡，而且部分證實(shí)了凋亡參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。但人們對缺氧下RPE細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制和特征卻了解甚少。
　　JNK和p38屬于絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinasea,MAPKs)家族，兩者通常由紫外線、滲透壓變化、細(xì)胞因子和生理激活因

3、素所啟動(dòng)，又被稱作MAPK應(yīng)激信號通路。已有證據(jù)表明ERK通路參與了RPE細(xì)胞的增生。對于大多數(shù)細(xì)胞來說，ERK1/2和JNK、p38在對細(xì)胞凋亡的調(diào)控中作用相反。因此有理由推測p38和JNK亦可能參與了缺氧導(dǎo)致的RPE細(xì)胞凋亡。
　　本研究旨在探討JNK和p38通路在缺氧誘導(dǎo)的RPE凋亡中的調(diào)控作用，為臨床防治缺血缺氧性眼內(nèi)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：觀察p38和JNK信號通路在缺氧誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)人RPE細(xì)胞凋亡中可能的

4、調(diào)控作用。
　　方法：
　　(1)將培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為1％O2、5％CO2和94％N2的培養(yǎng)箱內(nèi)建立缺氧模型。于缺氧后1、3、6、12和24h，用光鏡、掃描電鏡、Annexin-V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)(FCM)及TUNEL法檢測凋亡，于缺氧后1、2、3和4d后用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測RPE細(xì)胞的增生。
　　(2)于缺氧后1，3，6，12和24h，用Western blot檢測RPE

5、細(xì)胞內(nèi)p38蛋白的表達(dá)；以及用免疫組化及免疫熒光觀察p38和p-p38蛋白在RPE細(xì)胞內(nèi)的定位。用p38途徑抑制劑預(yù)處理RPE細(xì)胞30分鐘后置于缺氧孵箱內(nèi)培養(yǎng)3小時(shí)。Western blot檢測p38信號阻斷前后RPE細(xì)胞內(nèi)p38蛋白的表達(dá)。
　　(3)用p38通路抑制劑SB203580和JNK通路抑制劑SP600125預(yù)處理RPE細(xì)胞30分鐘，將RPE細(xì)胞置于缺氧孵箱內(nèi)培養(yǎng)3小時(shí)。用光鏡、透射電鏡、FCM及TUNEL法檢測對細(xì)胞

6、凋亡的影響；用MTT比色法檢測抑制劑對細(xì)胞增生的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)缺氧可致RPE細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞數(shù)隨缺氧時(shí)間延長而增加(P<0.01)，在3小時(shí)達(dá)高峰；MTT顯示，缺氧處理后的RPE細(xì)胞增生較快，缺氧后2、3和4d時(shí)，缺氧組較對照組A值顯著增大(P<0.01)。
　　(2)Western blot顯示缺氧1、3、6、12和24h時(shí)，均有磷酸化p38蛋白表達(dá)，3h水平最高，持續(xù)至24h。經(jīng)p38抑制劑處理后

7、細(xì)胞中磷酸化p38蛋白水平降低，表明SB203580能有效抑制p38的磷酸化；免疫組化顯示，常氧狀態(tài)下p38蛋白在RPE細(xì)胞胞漿和胞核中均有分布。缺氧后，細(xì)胞漿內(nèi)棕色強(qiáng)度減弱，胞核顏色明顯加深，提示p38蛋白由胞漿向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位。免疫熒光證實(shí)，常氧條件下p-p38蛋白熒光僅在RPE細(xì)胞胞漿內(nèi)有微量表達(dá)，胞核內(nèi)無表達(dá)。隨缺氧時(shí)間的延長，p38蛋白的磷酸化水平逐漸增高，細(xì)胞核熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，至3h表達(dá)最強(qiáng)，24h開始下降。
　　(3)

8、缺氧3小時(shí)時(shí)RPE細(xì)胞凋亡明顯；經(jīng)p38和JNK抑制劑處理的細(xì)胞凋亡水平明顯下降(P<0.01)；MTT未顯示抑制劑對細(xì)胞增生有影響(P>0.05)。
　　結(jié)論：缺氧不僅能誘導(dǎo)RPE細(xì)胞增生，亦能誘導(dǎo)凋亡。p38和JNK轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了缺氧誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞的凋亡。通過本課題的初步研究，有理由推測缺氧通過激活p38和JNK轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞的凋亡。本研究為下一步通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控缺氧下RPE凋亡提供了試驗(yàn)證據(jù)，亦為臨