大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷后膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白的表達(dá)變化研究及作用探討.pdf

1、第一部分：大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型的建立
　　 腦血管疾病已成為目前人類(lèi)的第三大重要的死亡原因之一[1]，特別是發(fā)病率、致殘率高，治愈率低，尤其是大面積、基底節(jié)區(qū)腦梗死對(duì)人類(lèi)危害更大，因此對(duì)該類(lèi)疾病的防治顯得非常重要，可為臨床實(shí)行超早期治療與康復(fù)護(hù)理訓(xùn)練打下基礎(chǔ)。因此就需要能制作出可靠的、能重復(fù)使用的、能模擬臨床病理生理變化的動(dòng)物模型。近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越多的使用線栓法制作大鼠局造性缺血性模型，在于它能近于模擬人類(lèi)大腦中動(dòng)脈腦缺

2、血病理過(guò)程[2]，從而達(dá)到科研的目的。人類(lèi)最為常見(jiàn)的缺血類(lèi)型就是大腦中動(dòng)脈梗塞，所以在實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物大腦中動(dòng)脈栓塞模型應(yīng)用的也就最多，參照Z(yǔ)ealonga線栓法，并加以改進(jìn)，在實(shí)驗(yàn)中使用聚乙烯醇處理后的兔須作為線栓制作MCAO模型，好處在于處理后線栓遇血發(fā)生膨脹，可使線栓能夠充滿(mǎn)所需要栓塞的血管，使血流完全中斷，進(jìn)而提高了模型制作的成功率；使用頸總動(dòng)脈（CCA）及頸外動(dòng)脈（ECA）兩種不同的進(jìn)線方法，通過(guò)比較神經(jīng)肌肉運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分、前庭功能評(píng)

3、分、腦梗死體積等，進(jìn)而得出兩種制作方法的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　 目的：
　　 用兩種進(jìn)線法建立Wistar大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血模型，比較這兩種方法的優(yōu)劣，以觀察模型的可靠性，為早期診治缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 選取健康清潔級(jí)Wistar大鼠70只。具體分組如下：對(duì)照組（5只）、假手術(shù)組（5只）、頸總動(dòng)脈（CCA）進(jìn)線組（30只）和頸外動(dòng)脈（ECA）進(jìn)線組（30只），后兩組按照處死時(shí)間

4、分6個(gè)亞組，即缺血再灌注后4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、32小時(shí)、64小時(shí)、128小時(shí)，6個(gè)亞組，每亞組5只大鼠，建立大鼠腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。參照Z(yǔ)ealonga的線栓法，加以改進(jìn)，使用兔須替代尼龍線，經(jīng)聚乙烯醇處理后分別由頸總動(dòng)脈（CCA）和頸外動(dòng)脈（ECA）進(jìn)線制作栓塞模型。缺血90分鐘后，向外抽拔線栓實(shí)現(xiàn)再灌注，然后在再灌注后4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、32小時(shí)、64小時(shí)、128小時(shí)聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)肌肉運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分法、前庭運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

5、法評(píng)價(jià)大鼠運(yùn)動(dòng)功能，3天后處死大鼠，測(cè)定大鼠大腦梗塞體積并進(jìn)行比較兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 頸總動(dòng)脈進(jìn)線法和頸外動(dòng)脈進(jìn)線法神經(jīng)肌肉功能評(píng)分、前庭功能評(píng)分、腦梗死體積分別為4.1±0.645和5.1±0.546、2.6±0.576和3.6±0.519、22.9％±4.6％和30.5％±3.5％，兩法比較神經(jīng)肌肉功能評(píng)分及前庭功能評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；兩法腦梗死體積相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0

6、.05）。
　　 結(jié)論：
　　 兩種方法制作的大鼠腦缺血模型的均出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，腦組織缺血梗死表現(xiàn)。與頸總動(dòng)脈進(jìn)線法相比，頸外動(dòng)脈進(jìn)線法大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分高、腦梗死體積大、成功率高，模型穩(wěn)定性好。
　　 第二部分：腦缺血再灌注損傷后膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白的表達(dá)與變化研究及作用探討
　　 鐵是生命體內(nèi)不可缺少的微量元素，同樣又是人體中最豐富的過(guò)渡金屬[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)鐵的功能遠(yuǎn)比人們想象的重要。鐵在人腦中分布

7、廣泛，但這種分布并不是均勻的。人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)的各種細(xì)胞中幾乎都有鐵的分布，如神經(jīng)元、少突觸膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和一部分星形膠質(zhì)細(xì)胞都含量較多，其中含鐵量最多的是少突膠質(zhì)細(xì)胞。腦內(nèi)鐵具有極其重要的作用，維持鐵的穩(wěn)念對(duì)機(jī)體非常重要，眾多的研究表明急性腦缺血后機(jī)體各器官會(huì)出現(xiàn)鐵代謝紊亂，鐵負(fù)荷過(guò)重可介導(dǎo)一系列的病理生理變化，從而誘發(fā)各種疾病。
　　 研究證明，鐵蛋白（transferrin，Tf）和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin

8、receptor，T：fR）是參與鐵在腦組織中吸收的兩種途徑的主要蛋白。研究發(fā)現(xiàn)鐵在腦細(xì)胞中的代謝機(jī)制與外周代謝機(jī)制大不相同，且前者代謝及平衡機(jī)制更為復(fù)雜，已有研究證明，鐵代謝的主要途徑是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白-fe（Tf-fe）參與的途徑，另外新發(fā)現(xiàn)的鐵代謝蛋白如膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Ferroportin1 FP1）、二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體（DMT1）等也參與了腦的鐵代謝過(guò)程。膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白（Hephaestin，Hp）是研究性連貧血（

9、sex-linked anemic，sla）小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白。該蛋白的表達(dá)有明顯的組織特異性，其中小腸高度表達(dá)。研究表明[4]在小鼠和大鼠的大腦皮層、紋狀體、脈絡(luò)叢、海馬、黑質(zhì)等腦區(qū)也有Hp mRNA和蛋白的豐富表達(dá)，最近有報(bào)道[5]人類(lèi)Hp在腸道神經(jīng)系統(tǒng)以及胰腺p細(xì)胞也有表達(dá)。Hp與銅藍(lán)蛋白（Ceruloplasmin，CP）屬同一家族，也是一含銅的亞鐵氧化酶，能將有毒的二價(jià)鐵氧化成無(wú)毒的三價(jià)鐵。到目前為止，已有報(bào)道

10、腦缺血后Hephaestin表達(dá)的變化，本研究目的是用不同種類(lèi)的大鼠在不同的缺血再灌注時(shí)段觀察Hephaestin的表達(dá)變化。
　　 目的：
　　 探討大鼠腦缺血再灌注后Hephaestin在大腦皮層、紋狀體表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化與再灌注時(shí)間的關(guān)系，初步探討Hephaestin在腦鐵代謝中的作用。
　　 方法：
　　 選取40只健康清潔級(jí)Wistar大鼠，隨機(jī)分為8組，每組5只。第一組（假手術(shù)組）僅分離頸總動(dòng)脈和

11、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，并不進(jìn)行插線；第二組為對(duì)照組，不做任何處理；第三組為缺血/再灌注組，依據(jù)再灌注后4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、32小時(shí)、64小時(shí)、128小時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)分為六個(gè)亞組；建立大鼠腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，免疫組化染色，通過(guò)Leica Q550IW系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算出損傷后不同時(shí)點(diǎn)大鼠大腦皮層、紋狀體區(qū)平均光密度值。
　　 結(jié)果：
　　 正常大鼠的大腦皮層、紋狀體都有Hephaestin表達(dá)，缺血側(cè)大腦皮層、

12、紋狀體再灌注后8小時(shí)表達(dá)明顯增加并持續(xù)到再灌注后64小時(shí)，表達(dá)高峰出現(xiàn)在再灌注16至32小時(shí)期間（P<0.05），至128小時(shí)表達(dá)較正常對(duì)照組有明顯減少（（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 大鼠腦組織中Hephaestin的表達(dá)在急性腦缺血再灌注后出現(xiàn)明顯的變化，研究表明，在腦缺血再灌注16-32小時(shí)后表達(dá)最為明顯，128小時(shí)后表達(dá)程度達(dá)到低谷。Hephaestin在急性腦缺血的病理生理變化中可能發(fā)揮著重要的作用，H