大鼠脊髓缺血再灌注損傷后自噬表達(dá)及作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分大鼠脊髓缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)
　　目的:建立大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，觀察不同缺血時(shí)間對(duì)脊髓缺血再灌注損傷后病理組織學(xué)和神經(jīng)功能評(píng)分的影響。
　　方法:構(gòu)建大鼠胸主動(dòng)脈球囊阻斷復(fù)合體循環(huán)低血壓(MAP=40mmHg)脊髓缺血再灌注模型，按不同的阻斷時(shí)間隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血8min組、10min組和12min組，評(píng)定再灌注24 h和48 h后神經(jīng)功能;觀察再灌注48 h后脊髓形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)

2、果:再灌注48 h后，缺血8min、10min和12min組出現(xiàn)截癱率分別為60％、100％和100％，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。再灌注48 h后，脊髓組織出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、壞死等改變，且隨阻斷時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷程度逐漸加重。
　　結(jié)論：成功建立大鼠胸主動(dòng)脈球囊阻斷復(fù)合體循環(huán)低血壓脊髓缺血再灌注模型。脊髓缺血10min是模型建立的最佳時(shí)間。
　　第二部分細(xì)胞自噬及其相關(guān)蛋白Beclin-1，LC3和P62在大鼠

3、脊髓缺血再灌注損傷組織中的表達(dá)
　　目的:觀察大鼠脊髓缺血再灌注損傷后損傷區(qū)細(xì)胞自噬是否存在，比較不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞自噬的表達(dá)情況。
　　方法:將大鼠隨機(jī)分為兩組，假手術(shù)組和缺血組，缺血組再分五個(gè)時(shí)間點(diǎn):3H，6H，12H，24H，48H。損傷組按照第一部分的方法制作脊髓缺血再灌注損傷模型，假手術(shù)組只置入導(dǎo)管而不打開球囊損傷脊髓，按照上述時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物后，用透射電鏡觀察細(xì)胞自噬，用熒光雙染法檢測(cè)LC3及Beclin1在各時(shí)間點(diǎn)的

4、表達(dá)和在各類脊髓組織細(xì)胞中的分布，Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1，LC3和P62的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:透射電鏡發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在損傷的神經(jīng)元細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)自噬囊體和自噬溶酶體明顯增加，脊髓損傷后3h開始，細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3表達(dá)即較對(duì)照組明顯上調(diào)，并且隨著時(shí)間持續(xù)升高，在傷后24h時(shí)達(dá)到高峰，傷后48h有回落，但仍高于基礎(chǔ)值，而自噬相關(guān)蛋白P62表達(dá)下調(diào)表達(dá)，和Beclin

5、1，LC3反相同步。缺血再灌注組Beclin1和LC3陽性細(xì)胞數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)明顯高于假手術(shù)組(p＜0.05)，趨勢(shì)與蛋白變化相符。脊髓神經(jīng)元細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞中均有Beclin1和LC3表達(dá)。
　　結(jié)論:1、脊髓缺血再灌注損傷中3H自噬表達(dá)明顯上調(diào)，24H到達(dá)高峰，48H下降。神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均可見自噬表達(dá)。自噬參與脊髓缺血再灌注損傷過程。
　　第三部分自噬抑制劑3-MA對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞自噬的影

6、響
　　目的:通過鞘內(nèi)注射自噬抑制劑3-MA，觀察自噬被抑制后對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響。
　　方法:將大鼠隨機(jī)分成三組:假手術(shù)組，單純?nèi)毖獡p傷組，3-MA組，每組分為傷后3H，12H，24H，48H各4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，神經(jīng)功能評(píng)分評(píng)價(jià)24h和48h小時(shí)后雙下肢神經(jīng)功能，脊髓前角神經(jīng)元計(jì)數(shù)，Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1，LC3和P62檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)的變化，組織熒光免疫法檢測(cè)各

7、組Beclin1和LC3陽性細(xì)胞變化。
　　結(jié)果:24H和48H后3-MA干預(yù)組較單純?nèi)毖M神經(jīng)功能評(píng)分顯著改善(P＜0.05)，在觀測(cè)的的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，3-MA治療組脊髓前角神經(jīng)元數(shù)明顯多于單純?nèi)毖M， Beclin1和LC3的蛋白上調(diào)表達(dá)和P62表達(dá)下調(diào)較單純?nèi)毖M明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3-MA組Beclin1和LC3的陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于缺血損傷組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論: