重樓皂甙Ⅰ抗非小細(xì)胞肺癌作用及機(jī)制的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景： 肺癌是目前世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤，而且全世界肺癌發(fā)病率還在以每年0.5％的速度增長。肺癌中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占75-80％，其五年生存率僅為8-15％。手術(shù)切除仍是NSCLC的首選治療，但大多數(shù)病人無法手術(shù)或僅可部分切除，3/4以上NSCLC病人在病程的某一階段適合化療或聯(lián)合化/放療。但目前最有效的化療方案對晚期NSCLC的緩解率僅30％左右；尋求

2、新的有效的肺癌治療藥物，進(jìn)一步提高臨床療效，已成為當(dāng)前迫切需要研究的課題之一。 重樓是中醫(yī)中藥抗癌配方中的常用藥物，其應(yīng)用已有上千年的歷史。資料顯示，重樓具有多種藥理學(xué)活性，主要有抗菌消炎、止痛鎮(zhèn)定及抗腫瘤作用，但是其總提取物或者單體提取物的抑制腫瘤的具體機(jī)制仍然不很清楚。重樓皂甙Ⅰ(polyphyllin Ⅰ，PP Ⅰ)是從重樓中提取出來的小分子單體，經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)它對腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用；但是其對NSCLC細(xì)胞的作用尚不

3、清楚。 本研究應(yīng)用MTT試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡、基因芯片、RT-PCR等技術(shù)和方法，深入研究重樓皂甙Ⅰ抗人NSCLC的可能機(jī)制。 二、材料與方法： 1、培養(yǎng)三個NSCLC細(xì)胞株：人肺腺癌A549細(xì)胞株、人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞株、人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞株；MTT法檢測不同濃度(0、0.625、1.25、2.5、10μg/ml)的PP Ⅰ對NSCLC細(xì)胞生長的抑制作用，選擇合適的濃度及作用時間點(diǎn)進(jìn)

4、行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 2、DNA ladder檢測2.5μg/ml的PP Ⅰ作用NSCLC細(xì)胞48h后對凋亡的作用，Western blot法檢測2.5μg/ml PP Ⅰ作用24h后對NSCLC細(xì)胞proeaspase-3和bel-2表達(dá)的影響。 3、流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測PP Ⅰ對NSCLC細(xì)胞周期的作用，流式細(xì)胞技術(shù)Annexin V-FITC法檢測A549凋亡細(xì)胞。 4、對數(shù)生長期的A549細(xì)胞5×106個/

5、只(100μl)接種于5周齡的BALB/c雄性裸鼠背部皮下，隨機(jī)分成隨機(jī)分為三組：PP Ⅰ組(11只)，順鉑(DDP)組(11只)和PBS對照組(11只)。接種第二天起開始經(jīng)腹腔注射100μl的PP Ⅰ或DDP或PBS,給藥劑量按PP Ⅰ：1.5mg/kg體重，DDP：1 mg/kg體重，一天兩次，共10天。研究PP Ⅰ在體內(nèi)對NSCLC生長的抑制作用。 5、采用SuperArray公司的寡核苷酸基因芯片(Cat.Human O

6、HS-802)檢測并分析各基因信號表達(dá)，進(jìn)而探討重樓皂甙Ⅰ的作用機(jī)理。 6、熒光定量RT-PCR方法(相對定量)對選擇的芯片結(jié)果中差異表達(dá)的5個感興趣的基因進(jìn)一步驗(yàn)證。 7、RT-PCR檢測P53和GADD45α、GADD45γ、GADD45β基因表達(dá)水平。 8、Western blot法檢測2.5μg/ml的PP Ⅰ作用于A549細(xì)胞AKT磷酸化水平變化。 9、統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)

7、行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以(白龠)±s表示，組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)或兩樣本率比較U檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有顯著性意義。 三、結(jié)果： 1、重樓皂甙Ⅰ在體外對NSCLC細(xì)胞生長的抑制作用MTT方法檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度(0、0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml)的PP Ⅰ作用于A549、NCI-H460、SK-MES-1細(xì)胞24、48及72h表現(xiàn)出抑制效應(yīng)。2.5μg/ml PP Ⅰ在三個

8、細(xì)胞株中作用24、48、72h均引起明顯的抑制，各時點(diǎn)A549的抑制率分別為51.9±7.1％、76.9±2.8％、84.7±4.8％，NCI-H460的抑制率為60.3±10.6％、49.1±7.5％、52.1±2.2％，SK-MES-1的抑制率為67.8±8.9％、60.2±2.7％、71.9±2.9％。10μg/ml PP Ⅰ對三種細(xì)胞的抑制率達(dá)到90％作用。A549、NCI-H460、SK-MES-1細(xì)胞半數(shù)抑制濃度IC50(4

9、8h)分別為1.24、2.40、2.33μg/ml。 2、重樓皂甙Ⅰ在體外誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的凋亡2.5μg/ml PP Ⅰ處理三種NSCLC細(xì)胞(A549、NCI-H460、SK-MES-1)48 h后，DNA ladder明顯可見特征性的50-300kb長的DNA大片段形成的“梯狀DNA條帶”，而對照組未見“梯狀DNA條帶”。2.5μg/ml PP Ⅰ作用三種細(xì)胞系24h后，Western blot結(jié)果顯示bcl-2的表達(dá)均

10、較對照組明顯下調(diào)，procaspase-3在PP Ⅰ組的含量也比對照組減少。 流式細(xì)胞術(shù)：細(xì)胞周期分析顯示經(jīng)2.5μg/mlPP Ⅰ誘導(dǎo)A549細(xì)胞不同時間后發(fā)現(xiàn)，G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例均顯著下降，而亞二倍體峰(凋亡細(xì)胞峰)隨著作用時間延長而增加，具有時間依賴性。Annexin V-FITC法檢測表明2.5μg/ml PP Ⅰ作用A549細(xì)胞24h的凋亡細(xì)胞比例為39.68％，明顯高于正常對照。 3、重樓

11、皂甙Ⅰ在體內(nèi)抑制A549細(xì)胞移植瘤生長重樓皂甙Ⅰ、DDP組與對照組PBS相比，均顯著減少腫瘤體積和總量，且重樓皂甙Ⅰ組比DDP組作用明顯，抑瘤率為PP Ⅰ組>DDP組>PBS組(P<0.05)，各組在治療期間無裸鼠死亡，體重變化無顯著差異，顯示良好的耐受性。 4、SuperArray Human OHS-802基因芯片分析，2.5μg/ml PP Ⅰ處理A549細(xì)胞后6h、12h上調(diào)兩倍以上的基因分別有104、34個，下調(diào)兩倍以

12、上的基因分別有有5、72個，有多個基因與凋亡有關(guān)，但BCl-2和BAX在6h和12h時變化不明顯。有些基因可能與重樓皂甙I抗腫瘤通路有關(guān)。 5、qRT-PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，驗(yàn)證了5個腫瘤信號通路的基因(PIK3CB、PH(3CG、PTEN、JUN、PCTK3)，兩種方法所得基因表達(dá)倍數(shù)大致相當(dāng)。 6、RT-PCR檢測PP Ⅰ誘導(dǎo)A549細(xì)胞P53、GADD45基因表達(dá)改變：經(jīng)2.5μg/mlPP Ⅰ誘導(dǎo)A549細(xì)胞6

13、h后GADD45α表達(dá)水平明顯高于空白對照組，12h后略有回落，但仍高于空白組水平,GADD45β、GADD45γ表達(dá)水平無改變。P53基因在6h后明顯表達(dá)上調(diào)。 7、Western blot檢測AKT磷酸化結(jié)果顯示：2.5μg/ml PP Ⅰ作用A549細(xì)胞后0h、6h、12h、24h各時點(diǎn)的總AKT沒有改變；而磷酸化AKT表達(dá)明顯降低，提示PP Ⅰ抑制A549細(xì)胞AKT磷酸化。 四、結(jié)論： 1、重樓皂甙Ⅰ在體

14、、內(nèi)外有不同程度的抗非小細(xì)胞肺癌的作用。 2、重樓皂甙Ⅰ在體外對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用。 3、重樓皂甙Ⅰ誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡可能是通過多種腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的基因?qū)崿F(xiàn)的，這些基因表達(dá)水平的綜合作用決定腫瘤細(xì)胞的凋亡與否。 4、重樓皂甙Ⅰ可能通過P53/GADD45/JUN信號通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，而且是通過GADD45α途徑。 5、重樓皂甙Ⅰ可以抑制AKT蛋白的磷酸化水平從而