茶氨酸神經(jīng)保護(hù)作用的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 從體外實(shí)驗(yàn)方面初步研究了茶氨酸對谷氨酸致體外原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞興奮性損傷的保護(hù)作用劑量范圍及其可能涉及的機(jī)理；通過建立大鼠腦缺血模型，初步研究了茶氨酸對腦缺血損傷的保護(hù)作用，并探索了其神經(jīng)保護(hù)功能與氧化酶活性、自由基水平的關(guān)系。為茶氨酸進(jìn)一步作為天然植物神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)用于神經(jīng)保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。 方法： 1、茶氨酸對PC12細(xì)胞alamar blue還原率的影響：將培養(yǎng)2-3天的PC12細(xì)胞以3×10<'5>/

2、ml的密度接種于96孔板，每孔100μl，37℃，5％CO<,2>條件下培養(yǎng)3-5d，加入5-10000gmol·L<'-1> 8個濃度梯度的茶氨酸工作液，同時設(shè)陰性對照和NaF損傷對照組繼續(xù)培養(yǎng)24h，24h后換液一次，再加同樣的受試物工作液培養(yǎng)24h后，加入alamar blue工作液測定細(xì)胞活力。 2、茶氨酸對原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞alamar blue還原率的影響：分離收獲新生1-3天Wistar大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)

3、胞，以3×10<'5>/ml的密度共培養(yǎng)法接種于96孔板，每孔100pll，37℃，5％CO<,2>條件下培養(yǎng)第7天加入終濃度10μmol·L<'-1>阿糖胞苷抑制非神經(jīng)細(xì)胞的生長，取培養(yǎng)12-14d的細(xì)胞，加入50-10000μmol·L<'-1>7個濃度梯度的茶氨酸工作液，同時設(shè)陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24h，24h后換液一次，再加同樣的受試物工作液培養(yǎng)24h后，加入alamarblue工作液測定細(xì)胞活力。 3、茶氨酸對Glu致

4、原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞興奮性損傷后細(xì)胞alamarblue還原率的影響：以上述方法培養(yǎng)大鼠原代大腦皮層細(xì)胞12-14d，加入5-1000μmol·L<'-1>7個濃度梯度的茶氨酸工作液，同時設(shè)陰性對照組、Glu損傷組、mk801保護(hù)組，繼續(xù)培養(yǎng)24h，24h后棄原培養(yǎng)基，所有保護(hù)組和Glu損傷組均加入終濃度為500μmol·L<'-1>的谷氨酸Earli e’s液作用15-20min，然后再置換成等體積的保護(hù)劑工作液，其中陰性和G

5、lu損傷對照組只加不完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，加入alamar blue工作液測定細(xì)胞活力。 4、茶氨酸對G1u致原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元興奮性損傷后細(xì)胞上清中μLDH漏出量和NO釋放量的影響：在六孔板中分離式原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元，待神經(jīng)元生長到7-10d時，分別加入5、10、100μmOL·L<'-1>3個濃度梯度的茶氨酸工作液，同時設(shè)陰性對照、Glu損傷對照、mk801保護(hù)對照組，每組6孔細(xì)胞，培養(yǎng)24h，24h

6、后棄原培養(yǎng)基，所有保護(hù)組和Glu損傷組均加入終濃度為500μmol·L<'-1>的谷氨酸Earlie’s液作用15-20min，然后再置換成等體積的保護(hù)劑工作液，其中陰性和Glu損傷對照組只加不完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后取上清，全自動生化分析儀測定細(xì)胞上清中LDH含量、化學(xué)法測定NO含量。 5、茶氨酸對Glu致原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元興奮性損傷后細(xì)胞內(nèi)nNOS、Caspase-3表達(dá)量的影響：按上述方法6孔板分離式原代培養(yǎng)大

7、鼠大腦皮層神經(jīng)元7-10d，加受試物作用48h后，取出生長有神經(jīng)元的玻片，按照免疫組化三步法步驟DAB染色測定神經(jīng)元內(nèi)nNOS、Caspase-3表達(dá)量，最后用image proplus5.2對細(xì)胞著色深淺進(jìn)行分析。 6、取4周齡體重90-100g SD大鼠30只，按體重隨機(jī)區(qū)組分為5組，每組6只：缺血模型組、假手術(shù)組、茶氨酸保護(hù)低(4.2mg/kg.BW)、中(8.3 mg&g.BW)、高(16.6 mg/kg.BW)劑量組。

8、動物每天灌胃給予一次受試物，對照組給予蒸餾水連續(xù)給予21d；末次給藥后，進(jìn)行單側(cè)頸動脈插線法制備永久性局灶性腦缺血模型，術(shù)后24h觀察動物體征并進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分，然后斷頭處死動物，取缺血側(cè)大腦半球，稱濕重，然后制備0.1％腦勻漿，3500r/min 4℃離心15min，取上清依次測定MDA、NO含量及GSH-px、ATP酶活性等指標(biāo)。 結(jié)果： 1、各劑量茶氨酸作用于受試細(xì)胞后，1000μmol·L<'-1>以下劑量茶氨

9、酸組細(xì)胞對alamar blue還原率均與陰性對照組無顯著差異，只有1000μmol·L<'-1>及以上茶氨酸劑量組細(xì)胞對alamarblue還原率與陰性對照組相比有所下降。 2、與陰性對照組相比，Glu損傷組細(xì)胞對alamarblue還原率顯著降低；而5-1000pmol·L<'-1>劑量的茶氨酸保護(hù)組細(xì)胞對alamar blue還原率均與陰性對照組無顯著性差異，其中10-500μmol·L<'-1>劑量的茶氨酸保護(hù)組細(xì)胞對a

10、lamar blue還原率顯著高于Glu損傷組。 3、與陰性對照組相比，Glu損傷組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH含量有所增高，NO含量顯著增高；而各保護(hù)組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH、NO含量與陰性對照組相比均無顯著性差異，與Glu損傷組相比均有所增高。 4、與陰性對照組相比，Glu損傷組細(xì)胞內(nèi)nNOS、Caspase-3表達(dá)量顯著增高，各保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)nNOS、Caspase-3表達(dá)量都顯著低于Glu損傷組。 5、茶氨酸處理

11、組腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺陷評分結(jié)果顯著低于缺血模型組。茶氨酸低中劑量組腦半球濕重顯著低于缺血模型組。 6、茶氨酸各處理組大鼠腦勻漿上清液中NO、MDA含量均與缺血模型組無顯著性差異，但是從數(shù)值上看各茶氨酸處理組NO、MDA含量均有小于缺血模型組的趨勢。 7、假手術(shù)組大鼠腦勻漿上清液中GSH-px及ATP酶活性高于缺血模型組。低劑量茶氨酸組酶活性顯著高于缺血模型組，各茶氨酸處理組酶活性結(jié)果在數(shù)值上均有高于缺血模型組的趨勢。

12、 結(jié)論： 1.體外實(shí)驗(yàn)顯示1000μmol·L<'-1>劑量以下的茶氨酸對體外培養(yǎng)PC12及大鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞都沒有可觀察到的毒性：5-500gmol·L<'-1>劑量的茶氨酸均具有拮抗谷氨酸毒性的作用，其適宜的作用劑量范圍為10-100μmol·L<'-1>。 2.5-100μmol·L<'-1>劑量的茶氨酸在體外可以顯著降低谷氨酸損傷后神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的NO水平、降低細(xì)胞的LDH漏出率、減少細(xì)胞內(nèi)nNOS