茶氨酸和茶氨酸合成酶活性的毛細(xì)管電泳檢測(cè)及酶學(xué)研究.pdf

1、　　本文主要在茶氨酸及其合成關(guān)鍵酶的檢測(cè)和初步純化等方面開(kāi)展了一系列工作?！　∈紫妊芯苛瞬枳训呐嘤龡l件，從不同組織中分離、提取茶氨酸合成酶，并初步探討一些理化因素對(duì)茶氨酸合成酶表達(dá)的誘導(dǎo)作用。通過(guò)制備丙酮粉，利用丙酮和硫酸銨沉淀法，從不同組織部位中提取茶氨酸合成酶。證實(shí)了丙酮粉粗酶液中，茶苗根中的茶氨酸合成酶活性約為茶籽苗和茶樹(shù)鮮葉的7.1倍，而其蛋白質(zhì)含量?jī)H為后兩者的1/4。運(yùn)用水楊酸浸泡、避光培養(yǎng)處理茶籽，茶苗表現(xiàn)出最高的茶氨酸合

2、成酶活性，說(shuō)明避光和水楊酸對(duì)茶氨酸合成酶表達(dá)具有誘導(dǎo)作用。　　然后建立了膠束電動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管電泳技術(shù)定量茶氨酸的新方法。試驗(yàn)以2，4-二硝基氟苯為衍生化試劑，在50℃的pH9.5硼酸緩沖液中作用25min后可以得到較穩(wěn)定的在360nm處有最大吸收峰的衍生化產(chǎn)物。研究了影響毛細(xì)管電泳分離效果的主要因素，確立了毛細(xì)管電泳分離的最佳條件。檢測(cè)了不同茶樣中的茶氨酸含量，測(cè)定了茶氨酸定量方法的性能指標(biāo)。從而證實(shí)了毛細(xì)管電泳技術(shù)定量茶樣中茶氨酸的可

3、行性?！　∑浯我阅z束電動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管電泳技術(shù)定量茶氨酸為基礎(chǔ)，論文還首次建立了一套茶氨酸合成酶活性檢測(cè)的新方法。通過(guò)優(yōu)化茶氨酸得出合成酶最佳反應(yīng)體系?？疾炝嗣阜磻?yīng)體系中可能影響毛細(xì)管電泳分離的各種因素。對(duì)茶氨酸合成酶純化液樣品進(jìn)行活性檢測(cè)，驗(yàn)證了茶氨酸合成酶毛細(xì)管電泳法分析的可靠性。并研究了茶氨酸合成酶初步純化液的部分酶學(xué)性質(zhì)：穩(wěn)定pH范圍為7.0-8.0以及酶的t1/2為15℃。　　同時(shí)運(yùn)用離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析嘗試了茶氨酸合成

4、酶的進(jìn)一步純化，最終純化倍數(shù)是丙酮粉粗酶液的42.4倍，另外，還篩選了茶氨酸合成酶的抑制劑，并初步探討了利用親和層析法純化茶氨酸合成酶的可行性。　　最后為了深入研究茶氨酸合成酶的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，系統(tǒng)分析了自然界中存在的同樣可以實(shí)現(xiàn)茶氨酸的酶法合成的其它三種酶。來(lái)自于假單胞菌的谷氨酰胺合成酶已被證實(shí)可以以谷氨酸和乙胺為底物合成茶氨酸；在細(xì)菌體內(nèi)廣泛存在的γ-谷氨基甲酰胺合成酶可以催化谷氨酸和甲胺生成γ-谷氨基甲酰胺；大腸桿菌產(chǎn)生的γ-谷