蘇木、川芎在體內(nèi)模型中對(duì)肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的干預(yù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是當(dāng)今癌癥死亡的最常見的原因，在過去的10年里，肺癌的5年生存率仍保持在15％左右，其中耐藥性的產(chǎn)生、腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響患者生存率的主要原因。對(duì)這一現(xiàn)象深入研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞(CSCs)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥性密切相關(guān)。目前，已經(jīng)有越來越多的實(shí)驗(yàn)研究證明，腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與腫瘤干細(xì)胞的存在有著密切關(guān)系。以腫瘤干細(xì)胞為治療靶點(diǎn)，可以有效預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，并且該觀點(diǎn)已經(jīng)在多項(xiàng)前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。
　　血瘀證是

2、中醫(yī)證侯中常見的證侯之一，其在肺癌等實(shí)體瘤中也占據(jù)主要地位。前期實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)肺癌等腫瘤患者普遍存在血瘀證，其嚴(yán)重程度可以從腫瘤患者血小板表面粘附蛋白表達(dá)的強(qiáng)度和數(shù)量得到證實(shí)。在活血藥物方面，我們觀察了雞血藤、水蛭、川芎、蘇木對(duì)肺癌微轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果顯示蘇木、川芎嗪對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移具有更明顯的抑制作用。同時(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，蘇木、雞血藤及二者聯(lián)合順鉑可以將腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并且可以抑制與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白PCNA、HIF-1α表達(dá)，另

3、外對(duì)P16-Cyclin D1-CDK4-RB途徑也具有調(diào)節(jié)作用，三者相互作用共同阻滯腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究即是在前期研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)在備受關(guān)注的CSCs理論，以川芎、蘇木作為活血藥的代表藥物，觀察不同劑量活血藥蘇木、川芎在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的干預(yù)作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　研究目的：
　　1.采用無血清球培養(yǎng)法分選PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群，并鑒定所獲得的球細(xì)胞具有無限增殖、抗凋亡、高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物等腫瘤

4、干細(xì)胞樣細(xì)胞性能。
　　2.建立PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞荷瘤小鼠模型，通過檢測瘤體內(nèi)ABCG2蛋白的表達(dá)，觀察蘇木、川芎在體內(nèi)環(huán)境中對(duì)肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的干預(yù)作用。
　　3.通過研究川芎、蘇木對(duì)腫瘤組織內(nèi)HIF-1α、EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的影響，探索活血藥對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的干預(yù)作用的相關(guān)機(jī)制，即可能是通過改善干細(xì)胞樣細(xì)胞所處的低氧微環(huán)境、抑制EMT發(fā)生起作用的。
　　研究方法：
　　1.采用無血清成球培養(yǎng)法

5、分選PG-BE1細(xì)胞系中的干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群，并采用流式細(xì)胞檢測、細(xì)胞調(diào)亡檢測、CCK-8檢測及western blot檢測干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志(ABCG2、S0X-2、0CT-4、Nanog)等驗(yàn)證其干性。
　　2.建立PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞動(dòng)物模型，采用激光共聚焦、western blot、RT-PCR分別檢測瘤體內(nèi)ABCG2蛋白表達(dá)，觀察不同劑量的川芎、蘇木對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的干預(yù)作用。
　　3.采用免疫組化、wes

6、tern blot、RT-PCR分別檢測瘤體內(nèi)HIF-1α、EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)，觀察川芎、蘇木對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞干預(yù)作用的相關(guān)影響機(jī)制。
　　研究結(jié)果：
　　1.無血清球培養(yǎng)的PG-BE1細(xì)胞在培養(yǎng)至第三天時(shí)，開始形成小的細(xì)胞球，培養(yǎng)到第6-7天時(shí)，細(xì)胞球表面顏色變暗、折光率降低，傳代至第三代時(shí)，球體更規(guī)則、立體。CCK-8實(shí)驗(yàn)提示PG-BE1球細(xì)胞組第3、4、5、6、7天的OD值明顯高于PG-BE1貼壁細(xì)胞，

7、二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01;細(xì)胞凋亡檢測提示PG-BE1球細(xì)胞與PG-BE1貼壁細(xì)胞早期凋亡率分別為為0.47％、3.54％，中晚期凋亡分別為1.99％、3.12％，總凋亡率分別為2.46％、6.68％，PG-BE1球細(xì)胞的早期凋亡率、總凋亡率均低于PG-BE1貼壁細(xì)胞，P＜0.05，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)PG-BE1球細(xì)胞高表達(dá)CD44+/CD24-標(biāo)志物，所占比例達(dá)99.02％;免疫熒光檢測提示，PG-BE1

8、球細(xì)胞中ABCG2呈高表達(dá)，而PG-BE1貼壁細(xì)胞ABCG2蛋白呈低表達(dá)甚至不表達(dá)狀態(tài)，兩組之間表達(dá)具有明顯差異;western blot檢測提示，ABCG2蛋白在PG-BE1球細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于PG-BE1貼壁細(xì)胞，Oct-4、Nanog在PG-BE1貼壁細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，而在PG-BE1球細(xì)胞中可見明顯表達(dá)，SOX-2在PG-BE1球細(xì)胞及貼壁細(xì)胞中的表達(dá)也具有明顯差異，其中Oct-4、SOX-2兩組中P＜0.01，Nano

9、g組、ABCG2組中P＜0.05。
　　2.激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度川芎可以明顯抑制ABCG2蛋白的表達(dá);單用DDP可以抑制ABCG2蛋白的表達(dá)，與蘇木、川芎配合使用，可以在單用活血藥的基礎(chǔ)上不同程度增強(qiáng)對(duì)ABCG2蛋白的抑制作用，其中高、低劑量蘇木+DDP組的抑制作用較強(qiáng);western blot發(fā)現(xiàn)，低劑量川芎對(duì)瘤體內(nèi)ABCG2蛋白有明顯的抑制作用，二者具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05，單用DDP組可抑制ABCG2蛋白的表

10、達(dá)，不過二者并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05;低劑量川芎+DDP組具有明顯抑制ABCG2蛋白的作用，不過與單用低劑量川芎相比，二者并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05;RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，低劑量川芎組可明顯下調(diào)ABCG2mRNA的表達(dá)，二者具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05;低劑量川芎與DDP配合使用，對(duì)ABCG2 mRNA的表達(dá)并無明顯抑制作用。
　　3.免疫組化檢測提示，除低劑量蘇木外，各組均可抑制HIF-1α表達(dá)，與對(duì)照組相比均

11、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05，單用DDP組可明顯抑制HIF-1α表達(dá)，配合低劑量蘇木、川芎聯(lián)合使用可以在單用低劑量蘇木、川芎的基礎(chǔ)上增強(qiáng)抑制作用，且具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05; western blot檢測發(fā)現(xiàn)，低劑量川芎與對(duì)照組相比可以有效抑制HIF-1α蛋白的表達(dá)，二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05;而單用DDP可以明顯抑制HIF-1α蛋白表達(dá)，而單用川芎與川芎配合使用DDP兩組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05; RT-PCR

12、檢測發(fā)現(xiàn)，低劑量蘇木、川芎可以抑制HIF-1α mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。
　　4.免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，除低劑量蘇木組外，各組對(duì)E-cadherin蛋白表達(dá)均呈促進(jìn)作用，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;DDP可明顯促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)P＜0.05，不過蘇木、川芎配合DDP干預(yù)并不能明顯促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá);高、低劑量蘇木均不能抑制N-cadherin蛋白表達(dá)，而其余各組N-cad

13、herin蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，P＜0.05; DDP可降低N-cadherin蛋白表達(dá)，與蘇木、川芎配合使用，較單用蘇木、川芎相比，可抑制N-cadherin蛋白表達(dá)，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05;低劑量川芎可抑制Vimentin蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。單用DDP可以抑制Vimentin蛋白表達(dá)，不過不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05，與蘇木、川芎合用并不能明顯增強(qiáng)其抑制作用。western blot檢測發(fā)現(xiàn)，

14、除低劑量蘇木組、DDP外，其余各組均可以促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)，低劑量活血藥配合DDP使用后，對(duì)E-cadherin蛋白的促進(jìn)作用明顯增強(qiáng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05;除蘇木組外，其余各組均可抑制N-cadherin蛋白的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05;與DDP配合使用后，對(duì)N-cadherin蛋白的抑制作用在單用活血藥的基礎(chǔ)上不同程度的增強(qiáng)，其中高、低劑量蘇木及高劑量川芎具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;低劑量活血藥可以抑

15、制Vimentin蛋白表達(dá)，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05;單用DDP對(duì)Vimentin蛋白的表達(dá)并無任何干預(yù)作用，與活血藥配合使用后，低劑量川芎+DDP組可明顯抑制Vimentin蛋白表達(dá)，低劑量川芎+DDP組與低劑量川芎組二者并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05;劑量川芎均可抑制Snail轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，P＜0.05;單用DDP對(duì)Snail的表達(dá)無作用，配合蘇木、川芎使用DDP均不能改善Snail的表達(dá)。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，低劑量川

16、芎組可以下調(diào)N-cadherin、Vimentin、Snail三者mRNA的水平，與對(duì)照組相比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05; DDP對(duì)N-cadherin、Vimentin、Snail三者mRNA表達(dá)并無明顯作用，蘇木、川芎與DDP配合使用后，反而促進(jìn)了三者mRNA的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。
　　研究結(jié)論：
　　1.經(jīng)無血清培養(yǎng)獲得的球細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力、抗凋亡能力，高表達(dá)ABCG2、N

17、anog、 Oct4、SOX2等腫瘤標(biāo)志物，證明用此方法獲得的PG-BE1球細(xì)胞具有干細(xì)胞樣細(xì)胞的干性。
　　2.低劑量川芎對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的生長有抑制作用，與DDP協(xié)同治療后，其抑制作用并無增強(qiáng)。低劑量川芎對(duì)ABCG2蛋白的抑制作用可能與其抑制ABCG2 mRNA的表達(dá)相關(guān)。因此認(rèn)為，低劑量川芎對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的殺傷作用可能是通過抑制ABCG2蛋白在mRNA水平上的表達(dá)達(dá)到的。
　　3.低劑量川芎可有效