rAAV2介導(dǎo)hBDNF基因聯(lián)合游泳訓(xùn)練對脊髓損傷大鼠治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　1、構(gòu)建以綠色熒光蛋白基因（Green fluorescence protein，GFP）為報(bào)告基因并攜帶人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）基因的2型重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV2-BDNF-GFP）。
　　2、大鼠脊髓損傷造模成功后，對其進(jìn)行基因治療和游泳康復(fù)訓(xùn)練，通過對其行為學(xué)、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的分析評價(jià)，以及與單一干預(yù)方法之間的比較，

2、探討基因治療聯(lián)合游泳康復(fù)訓(xùn)練對脊髓損傷的保護(hù)作用和影響。
　　研究方法：
　　1、以原有質(zhì)粒pTRGDNFGFP為模板，構(gòu)建含有人BDNF cDNA片段的重組質(zhì)粒pTRBDNFGFP并與AAV病毒包裝質(zhì)粒pAAV-RC、pHelper用PEI法共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。包裝獲得表達(dá)BDNF的2型重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV2-BDNF-GFP）。
　　2、采用“氯仿處理-PEG/Nacl沉淀-氯仿抽提”3個(gè)步驟純化病毒

3、。SDS-PAGE法檢測病毒純度，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測病毒滴度。重組病毒感染HEK293細(xì)胞后，采用Western Blot方法檢測細(xì)胞BDNF蛋白表達(dá)情況。
　　3、90只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，分別為單純游泳訓(xùn)練組（A組，n=18），單純基因治療組（B組，n=18），基因治療聯(lián)合游泳訓(xùn)練組（C組，n=18），假手術(shù)組（D組，n=18），自然愈合組（E組，n=18）。假手術(shù)組大鼠只敲除椎板暴露脊髓即可。其余4組采

4、用改良Allen’s打擊法制造大鼠脊髓損傷模型。
　　4、分別在造模前1d，造模后1d、3d、7d、14d、28d、42d對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行后肢運(yùn)動(dòng)功能評分（BBB評分和斜扳試驗(yàn)）。造模后14d、28d、42d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材，每組隨機(jī)抽取6只大鼠。取大鼠損傷段脊髓，制作冰凍切片后行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。
　　5、免疫組化染色切片用圖像分析軟件Image-pro plus 6.0分析處理。各種統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS

5、17.0進(jìn)行分析。
　　研究結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pTRBDNFGFP；包裝制備了2型重組腺相關(guān)病毒，純化濃縮后病毒滴度為6.8331011vp/ml；熒光顯微鏡下可觀察到被病毒感染后的HEK293細(xì)胞因表達(dá)GFP而發(fā)出綠色熒光；Western Blot檢測證明被重組病毒感染后的HEK293細(xì)胞具有表達(dá)BDNF的能力；
　　2、BBB評分和斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組在14d、28d、42d的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與單

6、一方法干預(yù)組（P<0.05）和自然愈合組（P<0.01）比較均有顯著提高，而單一方法干預(yù)組與自然愈合組比較也有顯著提高（P<0.05）。假手術(shù)組在損傷一周后即開始表現(xiàn)出與正常大鼠相似的運(yùn)動(dòng)功能。自然愈合組BBB評分和斜扳實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所提高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HE染色切片鏡下觀察發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組、單純游泳訓(xùn)練組和單純基因治療組與自然愈合組相比空洞和瘢痕較少，其中聯(lián)合治療組較為明顯；脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，相對于單一方法治療組和

7、自然愈合組，聯(lián)合治療組神經(jīng)元存活的數(shù)量較多（P<0.05）；免疫組化染色結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組平均光密度值明顯高于其它三組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　1、成功包裝2型重組腺相關(guān)病毒rAAV2-BDNF-GFP。
　　2、rAAV2-BDNF-GFP可以在脊髓組織中穩(wěn)定的表達(dá)BDNF蛋白，有助于軸突的再生，有利于神經(jīng)元的存活，從而促進(jìn)損傷脊髓部分功能的恢復(fù)。
　　3、合理的游泳訓(xùn)練和基因