rAAV2介導(dǎo)IGF-Ⅰ基因聯(lián)合間充質(zhì)干細胞對骨骼肌鈍挫傷小鼠修復(fù)作用的研究.pdf

1、骨骼肌損傷的防治一直是運動醫(yī)學領(lǐng)域中的熱點和難點，其傷后炎癥反應(yīng)期長，愈合質(zhì)量較差，容易形成瘢痕愈合。盡管國內(nèi)在分子生物學領(lǐng)域已經(jīng)取得一定進展，但是目前在臨床仍未能找到預(yù)防和治療骨骼肌損傷公認的最佳方案。
　　研究目的：本實驗對ICR小鼠進行骨骼肌鈍挫傷造模后，采用rAAV2介導(dǎo)的胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、人臍帶血間充質(zhì)干細胞(MSC)，對急性骨骼肌鈍挫傷小鼠進行干預(yù)治療，從組織學、生物化學等不同的研究層次和角度，探討基

2、因及間充質(zhì)干細胞對骨骼肌損傷的治療作用及可能機制，比較單純基因治療、單純間充質(zhì)干細胞、以及兩者聯(lián)合干預(yù)對骨骼肌鈍挫傷小鼠的修復(fù)效果，豐富相應(yīng)研究資料。
　　研究方法：動物分組與處理：將68只雄性ICR小鼠隨機分為空白對照組（4只）和實驗組（64只），實驗組小鼠骨骼肌鈍挫傷造模后平均分為四組，每組16只，各實驗組又根據(jù)取材時間不同，分為傷后3天組，傷后7天組，傷后14天組，傷后21天組。基因治療組（rAAV-IGF-Ⅰ）在造模后即刻

3、用微量注射器注射40μL重組腺相關(guān)病毒，間充質(zhì)干細胞組（MSC）注射106個細胞，聯(lián)合治療組(rAAV-IGF-Ⅰ-MSC)注射經(jīng)腺相關(guān)病毒感染后的間充質(zhì)干細胞106個，自然愈合組注射40μL PBS。
　　分別在損傷后3d、7d、14d、21d處死動物，眼球取血，留取血清，Eppendoff管密封保存于-80℃冰箱待測；速取損傷區(qū)域腓腸肌，用生理鹽水將殘留血液清洗干凈，其中二分之一置于凍存管中在液氮中速凍3-4小時，然后轉(zhuǎn)移至-

4、80℃冰箱保存待測，另外二分之一肌肉用10％福爾馬林固定，用于HE染色觀察及免疫組織化學實驗。
　　研究結(jié)果：（1）重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的近紅外熒光蛋白 iRFP713能夠在受傷肌肉組織中廣泛表達，對照組無表達。（2）HE染色光鏡觀察、血漿CK活性變化表明 MSC、rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC能促進小鼠急性腓腸肌鈍挫傷后的肌肉再生，減少疤痕形成，提高愈合質(zhì)量。（3）外源 IGF-Ⅰ能在小鼠腓腸肌中穩(wěn)定表達，在第

5、14d時，IGF-Ⅰ含量從高到低分別為rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組、rAAV-IGF-Ⅰ組、MSC組、自然愈合組、安靜對照組。（4）MSC、rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC能抑制骨骼肌鈍挫傷小鼠局部組織Collagen-Ⅰ、Ⅲ mRNA的表達，第7d、14d、21d,Collagen-Ⅰ mRNA的表達量均低于自然愈合組（P＜0.01），第3d，rAAV-IGF-Ⅰ組與自然愈合組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余

6、兩組差異顯著（P＜0.05）。第14d，rAAV-IGF-Ⅰ-MSC與 MSC組也表現(xiàn)出非常顯著性差異（P＜0.01）。21天，rAAV-IGF-Ⅰ組是MSC組的76%（P＜0.01），rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組是MSC組的58%（P＜0.01）。小鼠發(fā)生急性骨骼肌損傷3天和第7天時，各治療組Collagen-Ⅲ mRNA的表達量與自然愈合組相比均有顯著性差異（P＜0.01），組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。第14d，MSC組是自

7、然愈合組的74%（P＜0.05），rAAV-IGF-Ⅰ組是自然愈合組的63%（P＜0.01），rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組自然愈合組的42%（P＜0.01）。rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組的Collagen-Ⅲ mRNA的表達量與MSC組相比也具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。第21天，rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC兩組的Collagen-Ⅲ mRNA的表達量均低于自然愈合組（P＜0.01）。
　　研究結(jié)論：（