血液病患者血液中肺炎和發(fā)酵支原體的檢出.pdf

1、目的： 近年來國外研究表明肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)感染可能與兒童急性白血病有關(guān)，發(fā)酵支原體(Mycoplasmafermentans，Mf)感染可能與腫瘤相關(guān)且發(fā)酵支原體的慢性感染會影響腫瘤的形成速度。本研究旨在通過對血液病患者血液中肺炎和發(fā)酵支原體的分離培養(yǎng)、鑒定，探討血液病和支原體感染和血液病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)性，為血液病發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)因素研究提供一種新的生物學(xué)依據(jù)，為血液病的防治提供一

2、種新的途徑。 方法： 1.標(biāo)本來源： 2006年8月至2007年3月在浙江溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院就治的經(jīng)骨髓MICM(細胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、和分子生物學(xué))確定為血液病，胸片檢查心肺X線未見異常患者101例。其中，急性髓細胞白血病(AML)32例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)31例，原發(fā)性血小板減少癥(ITP)10例，急性淋巴細胞白血病(ALL)8例，慢性髓細胞白血病(CML)4例，再生障礙性貧血(AA)6例，慢

3、性淋巴白血病(CLL)2骨髓增生異常綜合癥(MDS)1例，多發(fā)性骨髓瘤(MM)3例，巨幼細胞性貧血(MA)1例以及真性紅細胞增多癥1例。取血液標(biāo)本進行支原體的分離培養(yǎng)及其鑒定。對照組65例為本院健康體檢職工的血液。 2.血液標(biāo)本的處理 血液標(biāo)本采自未經(jīng)抗生素治療被研究對象的清晨6時空腹靜脈血，不抗凝或抗凝(但不能加肝素抗凝，以免導(dǎo)致PeR假陰性)，采血后2h內(nèi)將標(biāo)本置于離心機內(nèi)離心5min(2500r/min)，分別抽取

4、上層血清或血漿0.2ml接種于SP4[1]、Uu和Mh液體培養(yǎng)基。取淋巴細胞層置于電鏡檢查瓶的底部，將電鏡液緩緩加于細胞層的上面。置4℃冰箱保存，以備電鏡檢查[1]。 3.分離培養(yǎng)及其鑒定 取確診但未經(jīng)治療的血液病患者和對照組血清血清接種改良的SP4和Uu和Mh液體培養(yǎng)基。置CO237℃3～7d，發(fā)現(xiàn)液體澄清，變黃，為初代培養(yǎng)。每次培養(yǎng)均做培養(yǎng)基對照管，對照管中只有液體培養(yǎng)基未加標(biāo)本。初代培養(yǎng)物過濾除菌后分別取0.1ml

5、轉(zhuǎn)種支原體固體培養(yǎng)基和普通血平板(排除L型細菌)，置CO237℃24～72h，置低倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)油煎蛋樣菌落，證實支原體生長。經(jīng)生化反應(yīng)初步判定，菌株置-20℃保存?zhèn)溆谩?4.巢式PCR鑒定 取經(jīng)生化試驗初篩的肺炎和發(fā)酵支原體菌株分別進行肺炎和發(fā)酵支原體PCR檢測，確認為檢出特異的肺炎和發(fā)酵支原體的DNA。 5.肺炎支原體抗體檢測 對所有研究對象和體檢對照組的血清標(biāo)本進行肺炎支原體特異抗體檢測。

6、 6.電鏡觀察 取經(jīng)PCR確定為肺炎和發(fā)酵支原體純培養(yǎng)物和血液超薄切片，電鏡下觀察支原體形態(tài)。 結(jié)果： 1.分離培養(yǎng)結(jié)果 101例血液病患者血液標(biāo)本中有17例分離培養(yǎng)陽性：血液病患者血液標(biāo)本接種改良SP4支原體液體培養(yǎng)基顏色變黃后，接種支原體固體培養(yǎng)基，低倍鏡下可見“油煎蛋樣”菌落。經(jīng)生化反應(yīng)初篩后，采用PCR進一步驗證。 2.PCR結(jié)果 取經(jīng)SP4液體培養(yǎng)陽性，生化初篩培養(yǎng)物，將符合肺炎

7、支原體和發(fā)酵支原體生化反應(yīng)的培養(yǎng)物分別進行肺炎支原體和發(fā)酵支原體巢式PCR擴增。101例血液病患者的血液中共計檢出肺炎和發(fā)酵支原體17例(16.8％)，其中9例(8.9％)在535bp區(qū)帶陽性，與肺炎支原體陽性對照一致，為肺炎支原體；8例(7.9％)在272區(qū)帶陽性，與發(fā)酵支原體陽性對照一致，為發(fā)酵支原體。65例對照組未檢出肺炎和發(fā)酵支原體，組間差異顯著(P＜0.01)。101例確診血液病患者的血液中未檢出Uu、Mh和Mpe。

8、3.肺炎支原體抗體結(jié)果 從101例白血病患者中共檢出Mp-IgG抗體陽性12例(11.8％)，陽性率高于M.pneumoniaePCR結(jié)果8.9％(9/101)，3例Mp-IgG抗體陽性分離培養(yǎng)為陰性。非血液病體檢對照組65例均為陰性。兩組間有顯著性差異(P＜0.05)。 4.電鏡觀察結(jié)果 血液標(biāo)本的超薄切片和純培養(yǎng)物在電鏡下均可見到支原體顆粒和支原體的形態(tài)。 結(jié)論：血液病患者血液中肺炎和發(fā)酵支原體的檢出