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1、氯霉素(Chloramphnicol,CAP)屬?gòu)V譜抗生素,能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的形成,廣泛用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療,特別是用于奶牛乳腺炎的治療,從而易使奶及奶制品中存在氯霉素殘留。由于氯霉素存在嚴(yán)重的副作用,可引起再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病,我國(guó)農(nóng)業(yè)部已禁止使用該藥,無(wú)論內(nèi)銷還是出口的畜產(chǎn)品,氯霉素殘留都是必檢項(xiàng)目。為保障我國(guó)人民的身體健康和國(guó)際貿(mào)易的需要,有必要建立靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法,對(duì)市場(chǎng)上的
2、牛奶等動(dòng)物性產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)測(cè)管理。 本文建立了牛奶中氯霉素殘留的微量分光光度法、熒光衍生化分光光度法、及柱前衍生化高效液相色譜法,并分別對(duì)三種方法進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià),用高效液相色譜法考察了牛奶、雞肉,蝦仁等動(dòng)物性食品中氯霉素的殘留量。論文主要工作如下: 一、微量分光光度法測(cè)定牛奶中氯霉素含量的方法 在參考有關(guān)文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上,利用還原偶氮反應(yīng)建立了微量分光光度法定量牛奶中氯霉素殘留的檢測(cè)方法,考察了方法的最佳反應(yīng)條件,
3、并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。 以乙酸乙酯萃取牛奶中的氯霉素,將氯霉素的硝基基團(tuán)在酸性條件下用氫還原,再加入亞硝酸鈉生成重氮鹽(過(guò)量亞硝酸加入氨基磺酸胺溶液除去)后,與N-1-萘乙二胺鹽酸鹽偶合,生成紫紅色的偶合產(chǎn)物N-1-萘乙二胺氯霉素,在λmax=555nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。吸光度(A)與氯霉素偶合產(chǎn)物濃度(μg·ml-1)在0.25~5μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(r2=0.9999),線性方程A=0.1545C+0.0313
4、。對(duì)牛奶中氯霉素的最低定量濃度為5ng·ml-1(ppb),檢出限為2.5ppb,氯霉素平均回收率為84.1%,平均RSD為6.6%。對(duì)陽(yáng)性樣品本方法的檢測(cè)結(jié)果與高效液相紫外檢測(cè)法測(cè)定結(jié)果一致。本方法儀器易普及、靈敏度較高、具有高選擇性,可以在基層單位推廣使用。 二、熒光衍生化光譜法測(cè)定牛奶中氯霉素含量的方法 氯霉素本身不發(fā)生熒光,但其苯環(huán)上的硝基基團(tuán)在酸性條件下用氫還原可轉(zhuǎn)化為芳香伯胺,能與熒光胺發(fā)生衍生化反應(yīng),形成具
5、有熒光的物質(zhì),定量測(cè)定其熒光強(qiáng)度,可進(jìn)一步提高方法的靈敏度,降低食品中氯霉素殘留的檢出限,以達(dá)到痕量檢測(cè)的目的。 本文建立了熒光分光光度法測(cè)定牛奶中氯霉素殘留量的方法,考察了熒光胺衍生化產(chǎn)物的熒光特征光譜,選擇:λex=404nm,λem=508nm為測(cè)定波長(zhǎng),對(duì)衍生化反應(yīng)的主要影響因素:緩沖液的pH值,熒光胺的用量,反應(yīng)所需時(shí)間等采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果表明,選擇pH7.6的磷酸二氫鉀-硼砂緩沖液1.35ml,熒光胺0
6、.500ml,室溫反應(yīng)8分鐘的條件下效果最佳。氯霉素?zé)晒庋苌a(chǎn)物濃度(ng·ml-1)與其熒光強(qiáng)度(F)在12.5ng·ml-1~500ng·ml-1之間呈線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程F=0.1424C+1.4415(r2=0.9998),方法測(cè)定牛奶中氯霉素殘留的最低測(cè)定濃度為2.5ppb,檢出限為0.9ppb,方法的平均回收率為85%,平均RSD為6.2%。 三、柱前衍生化-高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定動(dòng)物性食品中氯霉素的殘留量
7、 在光譜法測(cè)定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上建立柱前熒光衍生化HPLC-Flu法測(cè)定牛奶、雞肉、蝦仁中的氯霉素殘留,此法的靈敏度和選擇性較HPLC-UV法均有較大提高。 實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了色譜條件,采用十八烷基鍵合硅膠為固定相,醋酸鈉-醋酸緩沖液(0.02mol/l,pH6.0)-乙腈-四氫呋喃(76∶16∶8)為流動(dòng)相,柱溫40℃,熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為410nm,發(fā)射波長(zhǎng)為508nm。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(m)與色譜峰面積在2ng~4000ng范圍內(nèi)
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