紅細胞免疫分子、T細胞亞群水平及相關基因單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝細胞癌的關聯(lián)研究.pdf

1、1981年Siegel提出了“紅細胞免疫系統(tǒng)”的新概念，打破了劃分血細胞功能的傳統(tǒng)界限.2004年郭峰提出了血液免疫反應路線圖理論，認為血液中85％的免疫復合物被紅細胞黏附后運送到吞噬細胞、網狀內皮系統(tǒng)清除或通過遞呈給T細胞等途徑進行殺滅，紅細胞免疫在血液免疫反應中起主干道作用.在紅細胞免疫功能中，補體受體1(complement receptor type1，CR1)的免疫黏附功能和達菲抗原/趨化因子受體(Duffy antigen/

2、receptor for chemokines，DARC)的趨化因子受體功能最受關注，CD59則具有限制人補體系統(tǒng)溶細胞活性、介導紅細胞-T細胞信號傳遞的作用，而具有輔助功能的CD4+T細胞和具有抑制及直接殺傷功能的CD8+T細胞共同行使T細胞特異性免疫功能。
　　 我國系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病率居世界首位，治療屬世界難題，肝癌發(fā)病率和死亡率居高不下。研究實踐或理論推測表明，紅細胞CR1、DARC、CD59和T細胞亞群在SL

3、E和肝細胞癌(HCC)患者發(fā)生或可能發(fā)生表型改變，但缺乏綜合、詳盡研究，且紅細胞免疫分子表型檢測方法不規(guī)范，難以保證結果可靠性和可比性；目前缺乏這些分子的基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與疾病遺傳易感性的關聯(lián)研究，本研究探討了紅細胞免疫分子、T細胞亞群水平及相關基因SNP與SLE、HCC的關聯(lián)，主要研究內容、方法和結果如下：
　　 1.紅細胞CR1、CD59、DARC分子水平測定方法的建立及優(yōu)化：采用直標法流式細胞術測定各分子水平，

4、比較數(shù)據分析方法[陽性紅細胞百分率、幾何平均熒光強度(GMFI)和幾何平均熒光強度比值(GMFIR)]的可靠性，以及抗凝劑(EDTA-K2、肝素鋰、枸櫞酸鈉)、標本放置時間和抗體用量對測定結果的影響，
　　 2.候選基因SNP位點檢測方法的建立及優(yōu)化：采用配對標志法挑選候選基因標簽SNP，設計多重引物，單重PCR驗證多重PCR引物質量，采用多重PCR-熒光標記單堿基延伸.標簽微陣列雜交基因分型技術檢測91例健康人基因組DNA候選

5、標簽SNP，利用SNPstream()系統(tǒng)軟件確定個體基因型，分型成功率>90％的SNP位點入選后續(xù)研究；對46份DNA樣本重復測定，計算各SNP位點分型結果符合率.
　　 3.健康人紅細胞免疫分子、T細胞亞群水平及相關基因SNP位點特點：檢測健康人紅細胞CR1、DARC、CD59和T細胞亞群水平以及CR1等6個基因30個SNP位點；基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡(HWE)的SNP位點入選后續(xù)研究，利用Haplo

6、view V4.1軟件對SNP位點進行連鎖不平衡分析，采用四配子法構建單體型域，推算單體型頻率，分析各SNP位點基因分型及頻率>5％的單體型與性別的關聯(lián)；分析紅細胞免疫分子、T細胞亞群指標間及其與性別、年齡和SNP分型之間相關性，采用單因變量多因素一般線性模型篩選各指標主要影響因素.
　　 4.應激因素對紅細胞、T細胞免疫功能的影響：檢測4℃保存懸浮紅細胞及深、淺低溫體外循環(huán)(CPB)手術前后紅細胞CR1、CD59及T細胞亞群水

7、平，比較3種復合應激因素對紅細胞、T細胞免疫的影響趨勢、程度.
　　 5.紅細胞免疫分子、T細胞亞群水平及相關基因SNP與SLE的關聯(lián)：檢測SLE患者及健康人紅細胞CR1、DARC、CD59、T細胞亞群水平及27個SNP位點基因型，比較組間紅細胞免疫分子、T細胞亞群水平和基因型、等位基因及頻率>5％的單體型的分布差異，計算比值比(OR)及其95％可信區(qū)間(CI)。
　　 6.紅細胞免疫分子、T細胞亞群水平及相關基因SNP

8、與HCC的關聯(lián)：方法同SLE病例對照研究.
　　 結論：
　　 1.成功建立并優(yōu)化了直標法流式細胞術測定紅細胞CR1、CD59、DARC水平及多重PCR-熒光標記單堿基延伸.標簽微陣列雜交基因分型技術檢測候選基因標簽SNP的方法。
　　 2.調查了健康人紅細胞CR1、DARC、CD59，T細胞亞群水平，探討了各指標間的相關性及主要影響因素，確定了CR1等6個相關基因的27個標簽SNP位點入選后續(xù)研究，構建了6個單

9、體型域，各SNP位點基因型、等位基因、單體型頻率均無顯著性別差異。
　　 3.應激因素可損害紅細胞、T細胞免疫.4℃保存懸浮紅細胞對紅細胞CRl-GMFIR影響小，對CD59-GMFIR影響較大.深低溫CPB手術對紅細胞免疫有輕度損害，而淺低溫CPB損害較重；深低溫CPB手術導致免疫抑制，淺低溫CPB手術引發(fā)炎性反應.3種復合應激因素損害紅細胞免疫的程度依次為：4℃保存<深低溫CPB<淺低溫CPB。
　　 4.SLE患者

10、紅細胞，T細胞免疫功能降低，CR1-rs4844600、rs3818361、rs11118167， CD59-rs11585、rs12576440，CD4-rs1055141， CD8B-rs13400210、rs4832054等8個SNP位點以及CR1-rs11118167-rs3818361-rs17048010/TCT、CD59-rs831629-rs12576440-rs1738548-rs2231454/TGTG、CD4-rs