低氧對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞線粒體途徑凋亡的影響及葛根素的干預(yù)作用.pdf

1、目的： 1.研究低氧對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human pulmonary arterial smooth muscle cells，HPASMCs)線粒體途徑凋亡的影響； 2.研究葛根素對(duì)缺氧HPASMCs的干預(yù)作用及機(jī)制。 方法： 采用CCK-8染色法測(cè)定常氧和24小時(shí)低氧情況下HPASMCs的活性，及不同濃度葛根素(0.1μM，1μM，10μM，50μM，100μM，1Mm)對(duì)低氧HPASMCs活性的

2、抑制，并選擇合適濃度。人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分成3組：正常對(duì)照組(21％O2，5％CO2，24h)，24h低氧組(5％O2，5％CO2，24h)，24h低氧+葛根素組(5％O2，5％CO2，24h，葛根素終濃度：1mM)。每次實(shí)驗(yàn)前均用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓24小時(shí)使細(xì)胞同步化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。采用TUNEL法檢測(cè)各組HPASMCs凋亡指數(shù)；激光共聚焦顯微鏡羅丹明123(R-123)熒光染色法檢測(cè)各組HPASMCs線粒體膜電位(△ψm)；W

3、estern blot法分別檢測(cè)各組HPASMCs的胞漿和線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的蛋白含量；分光光度法測(cè)定各組HPASMCs的Caspase-9酶活性；免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定各組HPASMCs胞漿Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1.與常氧HPASMCs比較，24h低氧情況下HPASMCs CCK-8的吸光度(absorbance，A)值顯著升高(P<0.05)；葛根素濃度為1μM時(shí)，低氧HPASMCs的A值開(kāi)始下降，但未

4、達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；濃度在10μM-1mM之間，A值較單純低氧HPASMCs明顯下降(P<0.05)，并呈量效關(guān)系；葛根素濃度為1mM時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性的抑制率達(dá)21.7％，A值接近于正常值。 2.與正常對(duì)照組比較，24h低氧組的HPASMCs的凋亡指數(shù)有所減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；24h低氧+葛根素組的HPASMCs的凋亡指數(shù)較24h低氧組明顯升高，接近3.5倍。 3.24h低氧組較正常對(duì)照組HPAS

5、MCs的R-123熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.05)；24h低氧+葛根素組較24h低氧組HPASMCs的R-123熒光強(qiáng)度減弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 4.24h低氧組較正常對(duì)照組HPASMCs的線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C蛋白含量增加(P<0.05)，而胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C蛋白含量減少(P<0.05)；24h低氧+葛根素組較24h低氧組HPASMCs線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C蛋白含量減少(P<0.05)，而胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C蛋白含量增加(P<0

6、.05)。 5.與正常對(duì)照組比較，24h低氧組HPASMCs內(nèi)Caspase-9酶活性下降(P<0.05)；24h低氧+葛根素組較24h低氧組HPASMCs內(nèi)Caspase-9酶活性升高(P<0.05)。 6.與正常對(duì)照組比較，24h低氧組HPASMCs胞漿內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)兩者無(wú)明顯差異(P>0.05)；24h低氧+葛根素組較24h低氧組HPASMCs胞漿內(nèi)Bcl-

7、2蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，Bax蛋白含量減少(P<0.05)。 結(jié)論： 1.低氧可誘導(dǎo)肺動(dòng)脈甲滑肌細(xì)胞活性增加，凋亡減少。 2.低氧條件下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的線粒體途徑凋亡抑制，可能是低氧性肺動(dòng)脈高壓肺動(dòng)脈平滑肌肌層重構(gòu)的重要機(jī)制之一。 3.低氧條件下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)Bcl-2蛋白和Bax蛋白相對(duì)含量變化可能是導(dǎo)致線粒體途徑凋亡減少的重要機(jī)制之一。 4.葛根素具有促進(jìn)低氧性肺動(dòng)脈半滑肌細(xì)