白眉蝮蛇蛇毒中L-氨基酸氧化酶的純化鑒定及其肺損傷的作用.pdf

1、背景與目的:L-氨基酸氧化酶廣泛存在于蛇毒中,除外海蛇它能專一催化L-氨基酸的脫氨基作用,生成相應(yīng)的α-酮酸、氨和過(guò)氧化氫。
　　蛇毒L-氨基酸氧化酶大都含有兩個(gè)相同非共價(jià)結(jié)合的輔基FAD或者FMN。FAD或者FMN輔基在pH值改變或凍融過(guò)程特別容易脫離而導(dǎo)致酶活性的降低甚至喪失。目前對(duì)于L-氨基酸氧化酶在蛇毒中的作用還不是很清楚,目前認(rèn)為該酶有抗菌、誘導(dǎo)水腫、溶血、出血、抗病毒、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等活性。白眉蝮蛇主要分布在我國(guó)東北、韓

2、國(guó)、俄羅斯,該地區(qū)毒蛇咬傷主要是白眉蝮蛇所致。目前,從白眉蝮蛇蛇毒已經(jīng)分離部分組分,如磷脂酶A2(PLA2)、纖溶酶。本文從該蛇毒中分離到一個(gè)L-氨基酸氧化酶并通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定其表觀分子量約為60 kDa,通過(guò)高效液相色譜儀(HPLC)凝膠過(guò)濾測(cè)定其分子量為108.8 kDa,提示可能為同源雙亞基結(jié)構(gòu)。并首次系統(tǒng)研究了其對(duì)各種氨基酸底物的酶促動(dòng)力學(xué)及其誘導(dǎo)的肺損傷的作用。
　　方法:通過(guò)Heparin-Sepharose

3、FF及Q-Sepharose HP從白眉蝮蛇蛇毒中分離純化得到一個(gè)L-氨基酸氧化酶,命名為ABU-LAO。研究了其對(duì)各種氨基酸底物的酶促動(dòng)力學(xué)及不同pH條件和化合物對(duì)ABU-LAO酶活力的影響。BALB/c小鼠靜脈注射50,5,0.5μg藥物或生理鹽水100μL,每組6只,6 h或24 h后取材,心臟、肝臟、脾臟、腎臟及肺臟組織脫水包埋,常規(guī)切片,HE染色。肺臟切片高倍鏡視野下計(jì)算平均紅細(xì)胞數(shù)( RBCs)、平均肺泡內(nèi)多形核白細(xì)胞數(shù)(I

4、APLs)、平均肺泡隔多形核白細(xì)胞數(shù)(ASPLs);用圖像分析儀測(cè)平均肺泡面積(MACA)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0軟件完成。各組數(shù)據(jù)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)方法,P<0.05為有顯著性差異。組內(nèi)多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與同一對(duì)照組比較,P<0.0125(α'=α/K, K為重復(fù)比較次數(shù)+1)為有顯著性差異。
　　結(jié)果:1、通過(guò)兩步層析法從白眉蝮蛇蛇毒中分離、純化得到L-氨基酸氧化酶。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

5、測(cè)定其表觀分子量約為60 kDa,通過(guò)高效液相色譜(HPLC)凝膠過(guò)濾測(cè)定其分子量為108.8 kDa。L-氨基酸氧化酶約占蛇毒總蛋白質(zhì)含量的1.27％。
　　2、酶促動(dòng)力學(xué)研究白眉蝮蛇L-氨基酸氧化酶對(duì)L-Phe、L-Tyr、L-Leu、L-Trp、L-Ile等疏水性氨基酸活性較強(qiáng),但對(duì)L-Asn的活性比對(duì)疏水性氨基酸更強(qiáng),這是與其它蛇種L-氨基酸氧化酶明顯不同,可能與其活性中心的細(xì)微差別有關(guān)。L-氨基酸氧化酶在不同pH條件下催

6、化活性的變化較大。在pH4.4以下,pH10.4以上的條件下,其活性基本喪失。在pH4.8~5.6之間活性較高,酶的最高活性在pH5.2。表明在某種pH條件下時(shí)酶活性可在短時(shí)間喪失。CuSO4、ZnCl2、PMSF、葉酸、苯甲酸對(duì)酶活性有抑制作用。
　　3、肉眼觀察注射生理鹽水組小鼠未見(jiàn)任何改變。注射ABU-LAO50μg劑量作用后,6 h組6只小鼠中的2只肺臟出現(xiàn)明顯的斑點(diǎn)、腫脹;24 h組6只小鼠肺臟均出現(xiàn)斑點(diǎn),出血斑點(diǎn)明顯較

7、6 h組數(shù)量多、面積大、肺腫脹。5,0.5μg劑量組肺臟均未見(jiàn)明顯改變。計(jì)量病理學(xué)分析與生理鹽水組相比,RBCs、IAPLs、ASPLs、MACA在注射ABU-LAO后有顯著改變(P<0.0125)。
　　結(jié)論:1、通過(guò)兩步層析法從白眉蝮蛇蛇毒中分離、純化得到L-氨基酸氧化酶。整個(gè)分離純化過(guò)程緩沖液體系保持不變,有效避免了酶活性損失。有利于研究該酶的酶促動(dòng)力學(xué)及藥理學(xué)研究。
　　2、酶促動(dòng)力學(xué)研究表明白眉蝮蛇 L-氨基酸氧化

8、酶對(duì)疏水性氨基酸活性較強(qiáng)。可能不同蛇種 L-氨基酸氧化酶對(duì)各種氨基酸的活性表現(xiàn)有著種屬差異性,這種差異性可能與其活性中心的細(xì)微差別有關(guān)。在某種pH條件下時(shí)酶活性可在短時(shí)間喪失。某些金屬離子及化合物對(duì)酶活性有抑制作用?？赡芴崾灸承┗衔镆种?L-氨基酸氧化酶的活性,不僅僅是通過(guò)影響酶本身,而且可能是通過(guò)影響底物結(jié)構(gòu)的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)的,比如通過(guò)影響L-氨基酸的電離狀態(tài)來(lái)影響酶的活性。
　　3、ABU-LAO能引起小鼠急性出血性肺損傷,計(jì)量