白眉蝮蛇蛇毒L-氨基酸氧化酶的表征.pdf

1、蛇毒(SV)是由多種生物活性多肽、蛋白質(zhì)、核苷、胺和金屬離子等組成的復(fù)雜混合物。L-氨基酸氧化酶(LAAOs)作為蛇毒中的一個(gè)重要成分，有著多樣的生物學(xué)活性，其通過(guò)催化氧化L-氨基酸產(chǎn)生過(guò)氧化氫(H2O2)賦予蛇毒一定的毒性。目前，從蛇毒中分離得到的LAAOs以數(shù)十計(jì)，大量研究結(jié)果表明，蛇毒L-氨基酸氧化酶(SV-LAAOs)可以誘導(dǎo)或抑制血小板聚集、刺激水腫形成、誘導(dǎo)出血或溶血，具有抗凝活性、細(xì)胞毒性、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓、抗菌消炎

2、、抗利什曼原蟲(chóng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗HIV活性等多種生理作用。SV-LAAOs是一個(gè)新的毒性蛇毒蛋白群，是非常有趣的一類活性物質(zhì)，具有潛在的藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。
　　 采用離子交換、凝膠過(guò)濾層析及高效液相色譜層析從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇(Agkistrodon blomhoffii Ussurensis)蛇毒中純化了一種L-氨基酸氧化酶，命名為Akbu-LAAO。Akbu-LAAO在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAG

3、E)上顯示單一泳帶，結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF mass spectrometry)表征結(jié)果：Akbu-LAAO是由兩個(gè)相同亞基組成的分子量約為124.4kDa的二聚體。Akbu-LAAO經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)酶解，產(chǎn)生的肽段經(jīng)高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-nESI-MS/MS)進(jìn)行序列分析，蛋白鑒定采用TurboSequest Bioworks軟件完成，質(zhì)譜鑒定得到了10個(gè)肽段序列：WEELKR、YPV

4、KPSEEGK、KFWEDEGIHGGK、 VTVVYQTPAK、 HDDIFAYEK、 IKFEPPLPPK、SAGQLYEESLGK、 FDEIVGGMDK、RFDEIVDGMDK、 FDEIVDGMDKLPTAM＃YR。Akbu-LAAO與來(lái)源于蛇毒Calloselasma rhodost, Agkistrodonhalys, Daboia russellii siamensis和Trimeresurus stejnegeri的L

5、AAOs的氨基酸序列有同源性，但比對(duì)分析表明Akbu-LAAO是一種新的蛇毒LAAO。采用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)法，以L-亮氨酸(L-Leu)為酶的反應(yīng)底物，發(fā)現(xiàn)Akbu-LAAO水解活性的最適pH為4.7；在溶液pH為4.7時(shí)，Akbu-LAAO催化L-Leu反應(yīng)的Km值為2.1mM。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)檢測(cè)結(jié)果表明每個(gè)Akbu-LAAO分子中含有4個(gè)Zn2+，Zn2+的存在并不影響Akbu-LAAO的水解活性

6、，但是Zn2+的去除卻使Akbu-LAAO的最大熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度降低61％，這說(shuō)明Zn2+對(duì)Akbu-LAAO的水解活性不是必需的，但有助于維持酶結(jié)構(gòu)完整性。外源金屬離子Mg2、Mn2+、Ca2+、Ce3+、Nd3+、Co2+和Tb3+可以增加Akbu-LAAO對(duì)L-Leu的水解活性，另外，Ni2+、La3+和Gd3+輕微地降低了Akbu-LAAO水解L-Leu的活性，F(xiàn)e2+、Cu2+和Eu2+/Eu3+對(duì)其水解活性影響不大。我們發(fā)現(xiàn)

7、Akbu-LAAO對(duì)人和兔血小板的聚集有一定抑制及解聚作用，但抑制作用有顯著差別，以動(dòng)物血小板代替人血小板進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)有一定風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果表明Akbu-LAAO在治療心血管疾病方面將起到一定的作用。Akbu-LAAO能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，是相同條件下頭孢類藥物劑效的18倍，可作為潛在的抑菌劑使用。
　　 總之，本論文采用四步層析純化方法從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒中分離得到了一種新的天然的LAAO，具有一定潛在的藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值和臨床