白眉蝮蛇蛇毒L-氨基酸氧化酶的表征.pdf

1、蛇毒(SV)是由多種生物活性多肽、蛋白質(zhì)、核苷、胺和金屬離子等組成的復(fù)雜混合物。L-氨基酸氧化酶(LAAOs)作為蛇毒中的一個(gè)重要成分，有著多樣的生物學(xué)活性，其通過催化氧化L-氨基酸產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)賦予蛇毒一定的毒性。目前，從蛇毒中分離得到的LAAOs以數(shù)十計(jì)，大量研究結(jié)果表明，蛇毒L-氨基酸氧化酶(SV-LAAOs)可以誘導(dǎo)或抑制血小板聚集、刺激水腫形成、誘導(dǎo)出血或溶血，具有抗凝活性、細(xì)胞毒性、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓、抗菌消炎

2、、抗利什曼原蟲、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗HIV活性等多種生理作用。SV-LAAOs是一個(gè)新的毒性蛇毒蛋白群，是非常有趣的一類活性物質(zhì)，具有潛在的藥物開發(fā)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。
　　 采用離子交換、凝膠過濾層析及高效液相色譜層析從長白山白眉蝮蛇(Agkistrodon blomhoffii Ussurensis)蛇毒中純化了一種L-氨基酸氧化酶，命名為Akbu-LAAO。Akbu-LAAO在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAG

3、E)上顯示單一泳帶，結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF mass spectrometry)表征結(jié)果：Akbu-LAAO是由兩個(gè)相同亞基組成的分子量約為124.4kDa的二聚體。Akbu-LAAO經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)酶解，產(chǎn)生的肽段經(jīng)高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-nESI-MS/MS)進(jìn)行序列分析，蛋白鑒定采用TurboSequest Bioworks軟件完成，質(zhì)譜鑒定得到了10個(gè)肽段序列：WEELKR、YPV

4、KPSEEGK、KFWEDEGIHGGK、 VTVVYQTPAK、 HDDIFAYEK、 IKFEPPLPPK、SAGQLYEESLGK、 FDEIVGGMDK、RFDEIVDGMDK、 FDEIVDGMDKLPTAM＃YR。Akbu-LAAO與來源于蛇毒Calloselasma rhodost, Agkistrodonhalys, Daboia russellii siamensis和Trimeresurus stejnegeri的L

5、AAOs的氨基酸序列有同源性，但比對分析表明Akbu-LAAO是一種新的蛇毒LAAO。采用辣根過氧化物酶偶聯(lián)法，以L-亮氨酸(L-Leu)為酶的反應(yīng)底物，發(fā)現(xiàn)Akbu-LAAO水解活性的最適pH為4.7；在溶液pH為4.7時(shí)，Akbu-LAAO催化L-Leu反應(yīng)的Km值為2.1mM。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)檢測結(jié)果表明每個(gè)Akbu-LAAO分子中含有4個(gè)Zn2+，Zn2+的存在并不影響Akbu-LAAO的水解活性

6、，但是Zn2+的去除卻使Akbu-LAAO的最大熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度降低61％，這說明Zn2+對Akbu-LAAO的水解活性不是必需的，但有助于維持酶結(jié)構(gòu)完整性。外源金屬離子Mg2、Mn2+、Ca2+、Ce3+、Nd3+、Co2+和Tb3+可以增加Akbu-LAAO對L-Leu的水解活性，另外，Ni2+、La3+和Gd3+輕微地降低了Akbu-LAAO水解L-Leu的活性，F(xiàn)e2+、Cu2+和Eu2+/Eu3+對其水解活性影響不大。我們發(fā)現(xiàn)

7、Akbu-LAAO對人和兔血小板的聚集有一定抑制及解聚作用，但抑制作用有顯著差別，以動物血小板代替人血小板進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)有一定風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果表明Akbu-LAAO在治療心血管疾病方面將起到一定的作用。Akbu-LAAO能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌生長，是相同條件下頭孢類藥物劑效的18倍，可作為潛在的抑菌劑使用。
　　 總之，本論文采用四步層析純化方法從長白山白眉蝮蛇蛇毒中分離得到了一種新的天然的LAAO，具有一定潛在的藥物開發(fā)價(jià)值和臨床