L-谷氨酸氧化酶發(fā)酵條件及分離純化的研究.pdf

1、L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidise,簡(jiǎn)稱(chēng)GLOD)是80年代初開(kāi)始發(fā)現(xiàn)的一種新酶,最早從蛇的毒液、鼠的腎臟、無(wú)脊椎動(dòng)物和微生物等生物體中分離得到。它是以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基的黃素蛋白酶類(lèi),對(duì)L-谷氨酸生成H2O2、氨和α-酮戊二酸有很好的專(zhuān)一性,食品、醫(yī)藥、發(fā)酵等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用,成為一種非常實(shí)用的工具酶。但是目前,國(guó)內(nèi)對(duì)該酶的研究只是局限于產(chǎn)酶菌種發(fā)酵條件的優(yōu)化和對(duì)GLOD粗品的生產(chǎn),對(duì)GLOD純

2、品的制備非常少見(jiàn),使用的GLOD純品主要是由國(guó)外幾家公司生產(chǎn),價(jià)格非常昂貴,且偶有供貨不及時(shí)的現(xiàn)象,很大程度上限制了該酶的廣泛使用,因此GLOD純品的國(guó)產(chǎn)化勢(shì)在必行。
　　本研究選用山東省科學(xué)院生物研究所保存的華美鏈霉菌(Streptomyces splendens4.666)菌株,經(jīng)過(guò)復(fù)壯、活化,篩選出一株表現(xiàn)出高于其他菌株的產(chǎn)酶能力的菌株,并對(duì)其形態(tài)特性、生理生化特性進(jìn)行了檢測(cè),作為GLOD的生產(chǎn)菌株進(jìn)行下續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　

3、　為進(jìn)一步提高該菌株生物活性的利用價(jià)值,該研究對(duì)菌株的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。分別利用響應(yīng)面法進(jìn)行了培養(yǎng)基組成優(yōu)化和單因素試驗(yàn)法進(jìn)行了培養(yǎng)條件優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)得到最佳培養(yǎng)基組成:3.0％葡萄糖,3.2％蔗糖,2.2％玉米漿,1.0％硫酸銨,1.0％谷氨酸鈉,0.05％MgCl2,0.05％KCl,0.05％NaH2PO4,每個(gè)搖瓶加3％固體粉狀CaCO3;最適培養(yǎng)條件:培養(yǎng)基初始pH值為6.7,裝液量30mL,轉(zhuǎn)化溫度為28℃,轉(zhuǎn)化時(shí)間48

4、h,接種量3.0％,經(jīng)驗(yàn)證:優(yōu)化后GLOD產(chǎn)量明顯提高,由9.56g/L提高到19.1g/L,是初始GLOD產(chǎn)量的2倍。
　　利用Streptomyces splendens4.666發(fā)酵生成GLOD,設(shè)計(jì)出能達(dá)到較高純度的GLOD的分離純化路線。發(fā)酵液經(jīng)過(guò)高速冷凍離心、硫酸銨分級(jí)沉淀、Sephadex G-25脫鹽、MonoQ離子交換、Superdex G-200凝膠層析及冷凍干燥等步驟得到純化的GLOD。純化后的GLOD比活力

5、為176U/mg,純化收率為12.95％,純化倍數(shù)926倍。
　　純化后的GLOD經(jīng)SDS-PAGE電泳為單一條帶。SDS-PAGE和Superdex G-200凝膠層析分析顯示為約140 kDa的單鏈蛋白,說(shuō)明該酶經(jīng)過(guò)FPLC快速蛋白分離純化系統(tǒng),去除了大部分多糖雜質(zhì),純度檢測(cè)達(dá)到98.67％。
　　最后,對(duì)GLOD的酶學(xué)特性和應(yīng)用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,該GLOD的pH穩(wěn)定范圍為0～50℃,最適pH和最適溫度分別為pH7.

6、0和50℃,該酶催化L-谷氨酸的米氏常數(shù)Km為2.1×10-4mol/L,大多數(shù)金屬離子如Na+、K+、Mg2+對(duì)GLOD對(duì)酶活幾乎沒(méi)有影響,微量的Cu2+使酶活降低近50％,而Hg2+、Ag+則顯著抑制了酶的活性。我們將濃縮脫鹽后的酶液凍干,固定化制作成酶膜,應(yīng)用于生物傳感器中,并且與國(guó)外GLOD制成的酶膜活性相比較。
　　因此,本文只是為我國(guó)生產(chǎn)商品化的GLOD做些理論上及實(shí)踐上的初步探索,相比于國(guó)際化的商品酶,仍有較大距離。