干預(yù)Racl活性大鼠心臟驟停全腦缺血模型中的腦保護(hù)作用.pdf

1、由各種疾?。X卒中、微血栓、腦血管痙攣和硬化、腦血液動(dòng)力學(xué)改變、頸部動(dòng)脈疾病或椎動(dòng)脈受壓等）或手術(shù)（嚴(yán)重顱腦外傷手術(shù)、控制性降壓、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤夾閉術(shù)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)以及頸動(dòng)脈血管移植術(shù)、蛛網(wǎng)膜下腔出血等）所介導(dǎo)的全部或局部的腦組織短暫缺血，缺血腦組織恢復(fù)血流灌注后，腦組織損傷反而加重稱(chēng)為腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，I/R)。
　　神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血性損害非常敏感，長(zhǎng)時(shí)間的缺血打擊可導(dǎo)致神

2、經(jīng)細(xì)胞大量死亡，難以再生，從而留下許多嚴(yán)重甚至是不可逆的后遺癥。因此，如何實(shí)現(xiàn)圍術(shù)期腦保護(hù)一直是臨床麻醉醫(yī)師追求的目標(biāo)。研究某種能夠調(diào)動(dòng)機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，提高神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血性損害的抵抗力，減少?lài)?yán)重缺血導(dǎo)致的損傷，保證再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的正常生理功能，是缺血性腦病治療上的一個(gè)重要策略。探求腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制、尋找可減輕或預(yù)防腦缺血再灌注損傷的方法或藥物，已成為近年來(lái)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域廣大科研工作者致力的研究目標(biāo)。
　　全腦缺血后

3、活性氧尤其是氧自由基所引起的連鎖反應(yīng)是神經(jīng)元受損的核心病理環(huán)節(jié)。Rac1蛋白被認(rèn)為是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的生物調(diào)控開(kāi)關(guān)，當(dāng)有外源性的刺激因素存在時(shí)，Rac1與GDP脫離，并與三磷酸鳥(niǎo)苷GTP相結(jié)合而活化，隨后激活NADPH氧化酶從而產(chǎn)生活性氧簇。目前一些腦缺血再灌注研究發(fā)現(xiàn)在各種手段作用下降低Rac1活性將避免產(chǎn)生過(guò)多的活性氧參與腦缺血后神經(jīng)元的死亡或凋亡，但是針對(duì)Rac1在全腦缺血中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)機(jī)制方面的研

4、究仍然較少，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦損傷后是否受到其他因素的影響目前尚未明確，作為活性氧產(chǎn)生通路上的“開(kāi)關(guān)分子”Rac1與線粒體的抗氧化酶系統(tǒng)是否有相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制參與腦缺血再灌注損傷還需進(jìn)一步探索。
　　本實(shí)驗(yàn)首先利用食道電極建立心室停搏CA(cardiac arrest)全腦缺血GCI(global cerebral ischemia)模型，并在全腦缺血15min前經(jīng)側(cè)腦室注射Rac1特異抑制劑NSC23766(50μg)，觀察記錄大鼠

5、9天內(nèi)生存情況，通過(guò)Nissl染色評(píng)價(jià)大鼠海馬CA1區(qū)在腦缺血再灌注后神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變，觀察其中存活神經(jīng)元密度。TUNEL染色檢測(cè)48h海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況，觀察側(cè)腦室注射Rac1特異抑制劑NSC23766是否可減輕GCI后海馬神經(jīng)元損傷，證明該模型可以一定程度模擬臨床各種原因?qū)е碌男呐K停搏引發(fā)的嚴(yán)重全腦缺血損害;NADPH氧化酶“開(kāi)關(guān)分子”Rac1與全腦缺血再灌損傷有關(guān)。
　　第二部分以此模型為基礎(chǔ)研究抑制Rac1

6、活性對(duì)大鼠CA后腦神經(jīng)功能和氧化應(yīng)激的影響，通過(guò)側(cè)腦室注射Rac1活性抑制劑NSC23766，于CA/GCI后30min、3h、6h、1d、3d時(shí)取海馬CA1區(qū)組織檢測(cè)Rac1總量及活化蛋白含量，從WB水平驗(yàn)證側(cè)腦室注射N(xiāo)SC23766對(duì)Rac1活性的影響，通過(guò)改良NSS評(píng)分和Morris水迷宮檢測(cè)空間學(xué)習(xí)與記憶能力的等神經(jīng)功能改變，檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等指標(biāo)來(lái)反映神經(jīng)元的氧化應(yīng)激水平，結(jié)果證明抑制Rac1活性

7、對(duì)全腦缺血再灌損傷后大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力有保護(hù)作用，同時(shí)抑制Rac1活性可降低神經(jīng)元氧化應(yīng)激水平，提示抑制Rac1活性所產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用與降低神經(jīng)元氧化應(yīng)激水平有關(guān)。
　　第三部分則于CA/GCI后再灌注6h、1d、3d、5d各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)Trx2，Prx3的蛋白時(shí)間表達(dá)分布水平，研究線粒體抗氧化酶Trx2，Prx3在Rac1抑制劑處理后大鼠腦缺血再灌注損傷中的變化，探討機(jī)體清除氧化產(chǎn)物的還原能力特別是線粒體抗氧

8、化酶系統(tǒng)是否被輔助激活，關(guān)注抑制Rac1活性所產(chǎn)生的腦保護(hù)作用是否與激活、增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞的抗氧化酶系統(tǒng)清除活性氧能力有關(guān)。我們進(jìn)一步研究線粒體抗氧化酶在全腦缺血再灌注的保護(hù)機(jī)制，期望為防治全腦I/R損傷提供新的治療靶點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):①抑制Rac1活性可明顯減少缺血再灌注所導(dǎo)致的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡及錐體神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并可以使大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力的減退得到明顯改善，起到在全缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用。②使用Rac1抑制劑NS

9、C23766降低Rac1活性對(duì)大鼠再灌注損傷的腦保護(hù)作用與改善氧化應(yīng)激水平及氧化應(yīng)激的腦組織相關(guān)蛋白分子相關(guān)聯(lián)。③Rac1活性抑制劑處理后減輕大鼠腦缺血再灌注損傷降低組織氧化應(yīng)激水平的機(jī)制可能與腦組織線粒體抗氧化酶Trx2、Prx3表達(dá)無(wú)關(guān)。
　　本研究為進(jìn)一步闡明腦缺血再灌注損傷的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，也為Rac1與線粒體抗氧化酶Trx2，Prx3在缺血性腦損傷的重要作用提供理論依據(jù)和治療策略，同時(shí)嘗試為治療臨床缺血性腦病提供一條新

10、的思路。
　　第一部分:抑制Rac1活性對(duì)大鼠經(jīng)食道致顫腦缺血模型的神經(jīng)元保護(hù)作用
　　目的:建立SD大鼠經(jīng)食道電刺激心臟驟停全腦缺血再灌注模型，研究側(cè)腦室注射N(xiāo)SC23766抑制Rac1活性在該模型中的神經(jīng)元保護(hù)作用。
　　方法:經(jīng)食道插入調(diào)搏電極至心臟水平，用恒定電流誘發(fā)心臟驟停，無(wú)干預(yù)觀察6min后進(jìn)行心肺復(fù)蘇。選擇雄性SD大鼠(250-300g)，隨機(jī)分為四組:Sham組，CA組，NSC組(全腦缺血15min前

11、經(jīng)側(cè)腦室置管注射Rac1特異抑制劑NSC23766)，Vehicle組。記錄各組大鼠9d內(nèi)生存情況，于I/R后2d檢測(cè)各組大鼠腦水腫情況，大鼠海馬CA1區(qū)行TUNEL染色記錄凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，I/R后9d取大鼠海馬CA1區(qū)行Nissl染色，觀察存活神經(jīng)元密度。
　　結(jié)果:大鼠心臟驟停后全腦缺血NSC23766治療組與CA模型組相比生存率顯著提高(P＜0.05)。NSC組與CA組相比腦水含量減少，海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多(P＜

12、0.05)，遲發(fā)性神經(jīng)元死亡明顯減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:經(jīng)食道電刺激心臟驟停全腦缺血模型可模擬臨床心臟驟停后腦損害;抑制Rac1活性可明顯減少缺血再灌注所導(dǎo)致的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡及錐體神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　第二部分:抑制Rac1活性對(duì)大鼠CA后腦神經(jīng)功能和氧化應(yīng)激的影響
　　目的:探討抑制Rac1活性對(duì)大鼠心臟驟停全腦缺血后腦神經(jīng)保護(hù)作用與氧化應(yīng)激的關(guān)系。
　　方法:經(jīng)食道插入調(diào)搏電極至心臟水平，用恒定電流

13、誘發(fā)心臟驟停，無(wú)干預(yù)觀察6min后進(jìn)行心肺復(fù)蘇制作全腦缺血再灌注模型。選擇雄性SD大鼠(250-300g)，隨機(jī)分為四組:Sham組，CA組，NSC組，Vehicle組（CA前15min經(jīng)側(cè)腦室置管注射N(xiāo)SC23766）。于再灌注后6h、1d、2d及4d時(shí)行NSS評(píng)分;再灌注第2d各組檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，第7d行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:缺血再灌注后6小時(shí)大鼠海馬CA1區(qū)Rac1活性明顯高于假

14、手術(shù)組（P＜0.05）。同CA組相比，NSC組缺血再灌注后6h大鼠海馬CA1區(qū)Rac1活性顯著降低，改良NSS評(píng)分各時(shí)間點(diǎn)都降低，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中缺血再灌后第7天和第8天搜索安全島平臺(tái)潛伏期、運(yùn)動(dòng)軌跡有明顯改善，空間探索試驗(yàn)時(shí)NSC組第2象限停留時(shí)間百分比和穿越原平臺(tái)的次數(shù)明顯增加(P＜0.05）。氧化應(yīng)激檢測(cè)結(jié)果顯示，缺血再灌發(fā)生時(shí)抗氧化物質(zhì)SOD降低而脂質(zhì)氧化標(biāo)志物MDA升高，NSC組與CA組相比水平升高，MDA水平降低(P

15、＜0.05）。
　　結(jié)論:抑制Rac1活性在大鼠經(jīng)食道電刺激心臟驟停全腦缺血模型中可以通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平，改善大腦缺血再灌注的神經(jīng)功能損傷，發(fā)揮其在全腦I/R損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第三部分線粒體抗氧化酶 Trx2，Prx3在大鼠腦缺血再灌注損傷中的變化
　　目的:通過(guò)評(píng)價(jià)線粒體抗氧化酶Trx2，Prx3在Rac1抑制劑處理后大鼠腦缺血再灌注損傷中的蛋白表達(dá)變化，探討線粒體抗氧化酶在大鼠腦缺血再灌注損傷的可能保護(hù)

16、機(jī)制。
　　方法:經(jīng)食道插入調(diào)搏電極至心臟水平，用恒定電流誘發(fā)心臟驟停CA，無(wú)干預(yù)觀察6min后進(jìn)行心肺復(fù)蘇制作全腦I/R模型。選擇雄性SD大鼠(250-300g)，隨機(jī)分為四組:Sham組，CA組，NSC組（全腦缺血15min前經(jīng)側(cè)腦室注射Rac1特異抑制劑NSC23766），Vehicle組。于再灌注后6h、1d、3d、5d取海馬CA1區(qū)組織行Western blot檢測(cè)硫氧還蛋白酶Trx2及線粒體過(guò)氧化氫酶Prx3的表達(dá)。<