Alu串聯(lián)序列抑制GFP報告基因表達.pdf

1、目的：基因組學(xué)的研究表明，98％的基因組DNA屬于非編碼DNA，在非編碼DNA中重復(fù)序列的含量最高，約占50％，對于這樣的事實一直不能很好的解釋。近年來的研究表明重復(fù)序列與多種生物學(xué)現(xiàn)象有關(guān)：基因轉(zhuǎn)座，基因突變，腫瘤發(fā)生，自身免疫病，生物進化等。Alu元件屬于重復(fù)序列中的短散布核元件(Short Interspersed Nuclear Elements)，約占人類基因組的10％，在人類基因組中約有1，000,000個拷貝。近年來越來越

2、多的證據(jù)表明Alu序列對人類基因組的結(jié)構(gòu)、功能以及進化等方面有重要的影響。雖然對重復(fù)序列的研究取得了一定的進展但是對于其功能及機理性的研究還需要進一步的探討。 本實驗是在pEGFP-Cl質(zhì)粒的報告基因GFP的下游依次裝入1，2，4，8，14個首尾串聯(lián)的Alu序列，然后在GFP基因和Alu14(14個串聯(lián)Alu)之間加入SV40早期mRNA加尾信號SV40-polyA反序(240bp)，共構(gòu)建出6個重組質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HeL

3、a細胞中，觀察GFP綠色熒光蛋白的表達，研究基因的下游不同長度的Alu序列對上游基因表達的影響，為短散布核元件的功能研究積累實驗資料。 方法： 1 串聯(lián)表達載體構(gòu)建用基因分析軟件找出pEGFP-Cl(pEGFP)質(zhì)粒多克隆位點具有(Fig.1 Fig．2)但是待插入序列不具有的酶切位點。經(jīng)分析Alu序列不含有EcoR Ⅰ，HindⅢ，Nhe Ⅰ，Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位點。Xba Ⅰ和NheⅠ兩種核酸內(nèi)切酶切出的粘性

4、末端可以用T4DNA連接酶連接，但是連接以后則對Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ兩種核酸內(nèi)切酶均不敏感。利用這種特性可以制備插有不同個數(shù)Alu串聯(lián)重復(fù)序列的質(zhì)粒。設(shè)計引物上游帶有EcoR Ⅰ，Xba Ⅰ酶切位點，下游帶有Kpn Ⅰ，Nhe Ⅰ酶切位點，用RP11-29107克隆作為模板，擴增Alu序列。EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ作為Alu插入的位點，制備pEGFP-Alul(以下簡稱P-Alul)。pEGFP-Alu2的制備過程為：用HindⅢ和X

5、ba Ⅰ酶切構(gòu)建好的pEGFP-Alul質(zhì)粒，膠回收大片段，HindⅢ和Nhe Ⅰ酶切，膠回收小片段(Fig.3)，再將大、小片斷用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌，PCR篩選含有目的序列的陽性菌，進一步用酶切和測序鑒定。反復(fù)重復(fù)上述步驟制備pEGFP-Alu4、pEGFP-Alu8。酶切和連接pEGFP-Alu4(以下簡稱p-Alu4)和pEGFP-Alu2(以下簡稱p-Alu2)質(zhì)粒獲得pEGFP-Alu6(以下簡稱p-A

6、lu6)，再用pEGFP-Alu6和pEGFP-Alu8(以下簡稱p-Alu8)制備pEGFP-Alu14(以下簡稱p-Alu14)質(zhì)粒。 2 pEGFP-polyAas-Alu14(以下簡稱p-polyAas-Alu14)構(gòu)建在P-Alul4質(zhì)粒GFP基因下游插入SV40早期mRNA加尾信號SV40-polyA反序(240bp)，稱為P-polyAas-Alu14。 3 細胞轉(zhuǎn)染和熒光計數(shù)將構(gòu)建好的六種質(zhì)粒和pEGFP

7、-Cl以質(zhì)脂體法分別轉(zhuǎn)入HeLa細胞，培養(yǎng)24小時后在熒光顯微鏡下觀察。在x100倍視野白光下計數(shù)細胞總數(shù)，同樣視野紫蘭光下計數(shù)熒光陽性細胞數(shù)并在熒光和白光下拍下細胞照片。計數(shù)細胞總數(shù)至少500個，按以下公式計算熒光細胞陽性率：熒光細胞陽性率=熒光陽性細胞數(shù)/同樣視野細胞總數(shù)×100％。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準差(x+SD)表示。 結(jié)果： 1 構(gòu)建出的p-Alul，p-Alu2，p-Alu4，p-Alu8，p-Alu14質(zhì)粒

8、及p-polyAas-Alu14的鑒定。 (1)p-Alul，p-Alu2，p-Alu4，p-Alu8，p-Alu14質(zhì)粒酶切鑒定圖譜(Fig.4 Fig.5)。 (2)p-polyAas.Alul4鑒定的序列和測序(Fig.6Fig.7)。 2 P-Alu1、p-Alu2、p-Alu4、p-Alu8、p-Alu14、p-polyAas-Alu14和pEGFP-Cl七種質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，24小時后熒光照片

9、及熒光計數(shù)結(jié)果(Table 1 Fig.8 Fig.9)各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光細胞陽性率均值分別為：P-Alul 17.4±0.7％、p-Alu2 13.7±1.31％、P-Alu4 10.2±0.41％、p-Mu8 5.6±0.27％、p-Mu14 0.07±0.16％、p-polyAasAlu14 10.0±0.26％和pEGFP-Cl 35.3±2.66％。 結(jié)論： 1 成功的在pEGFP-Cl質(zhì)粒中插入了不同串聯(lián)數(shù)目(