Alu、L1-ORF2片段抑制GFP基因表達(dá)和SV40PolyA序列解除抑制研究.pdf

1、目的： Alu和L1(long interspersed nuclear element 1，長(zhǎng)散布重復(fù)序列1)兩種重復(fù)序列占人類(lèi)基因組DNA的27％，研究其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)理對(duì)于認(rèn)識(shí)非編碼序列的生物學(xué)作用，了解人類(lèi)基因組結(jié)構(gòu)的功能有重要意義。實(shí)驗(yàn)研究和基因組學(xué)分析顯示L1與基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)；在容易失活的基因、等位排斥基因及其側(cè)翼存在較多的L1序列，比如免疫細(xì)胞的B細(xì)胞受體基因，T細(xì)胞受體基因，細(xì)胞因子中的白介素2基因等。多數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示A

2、lu下調(diào)基因表達(dá)，基因組分析和少數(shù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示Alu可以促進(jìn)基因表達(dá)，在人類(lèi)基因組中Alu元件可以散在分布也可以串聯(lián)分布；在基因組中L1重復(fù)序列多數(shù)是不完整的序列，所以有必要研究串聯(lián)Alu和L1片段對(duì)基因表達(dá)的影響。本文中將Alu或/和L1片段插入質(zhì)粒報(bào)告基因下游，觀察插入序列對(duì)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄量及轉(zhuǎn)錄終止的影響，再將SV40PolyA序列插入GFP基因下游，觀察Alu和ORF2作為基因側(cè)翼序列對(duì)基因表達(dá)的影響，并對(duì)Alu序列是否影響染色質(zhì)

3、構(gòu)象進(jìn)行研究。 方法： 1.表達(dá)載體構(gòu)建合成帶適當(dāng)酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增pORF2質(zhì)粒上的ORF2片段(L1第2讀碼框的1006bp-1285bp，稱(chēng)為280-4)，酶切后插入pEGFP-C1質(zhì)粒，獲得pEGFP-280-4*1(p280-4*1)，重復(fù)插入280-4構(gòu)建出p280-4*2，0280-4*4，p280-4*8，p280-4*14串聯(lián)表達(dá)載體。 將酶切回收的280-4*1，280-4*2和280

4、-4*4按正、反方向插入pAlul4的Alul4上游，獲得六種質(zhì)粒。 pORF2(L1-ORF2插入pEGFP-C1質(zhì)粒)，pAlul，pAlu2，pAlu4，pAlu8，pAlul4(pEGFP-C1質(zhì)粒GFP基因下游插入1，2，4，8或14個(gè)Alu)，pA-Alul4(pAlul4的Alul4上游插入PolyA正序)，pAas-Alul4(pAlul4的Alul4上游插入PolyA反序)，pAA-Alul4(pAlul4的A

5、lul4上游插入去除AATAAA的PolyA正序)，pAAas.Alul4，pA-ORF2和pAas-ORF2為本研究室前期工作制備，本研究所用表達(dá)載體見(jiàn)表達(dá)載體一覽表(Table 1)。 2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光觀察將表達(dá)載體用LipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)觀察GFP熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。 3.Northem雜交用PCR法制備32P標(biāo)記的GFP探針。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，甲醛變性瓊脂糖

6、凝膠電泳，將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜。52P標(biāo)記的GFP探針雜交、沖洗后放射自顯影。然后尼龍膜用剝離液處理，用檢測(cè)neo RNA的探針再次雜交，放射自顯影作為對(duì)照。 4 DNase Ⅰ消化敏感性PCR擴(kuò)增需要完整的模板，經(jīng)DNase Ⅰ切斷的模板不再能被PCR擴(kuò)增，開(kāi)放的染色質(zhì)對(duì)DNase Ⅰ消化敏感，而纏繞的染色質(zhì)對(duì)DNase I相對(duì)抵抗，所以DNase Ⅰ消化后，用PCR擴(kuò)增染色質(zhì)的一定區(qū)段可以約略估計(jì)該區(qū)域的染色質(zhì)包裝狀態(tài)。pA

7、lul和pAlul4轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取細(xì)胞核，用DNase Ⅰ消化1分鐘或3分鐘時(shí)間，終止反應(yīng)后作為PCR模板，使用四對(duì)引物分別擴(kuò)增GFP基因和融合基因。 結(jié)果： 1.重組質(zhì)粒鑒定構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)核酸內(nèi)切酶酶切分析，PCR分析和測(cè)序后可知，重組質(zhì)粒中所插入的片段與預(yù)期長(zhǎng)度一致，核苷酸序列正確無(wú)誤。Fig.2為280-4串聯(lián)表達(dá)載體酶切電泳圖；Fig.3為p280-4*2測(cè)序圖及序列。Fig.4為280-4*1，串2，*4正、反方向插

8、入pAlu14表達(dá)載體的酶切電泳圖和PCR電泳圖。酶切，PCR和測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)要求和參照序列一致。 2.Alu和280-4串聯(lián)序列對(duì)GFP基因表達(dá)的影響質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，p280-4*1，p280-4*2，p280-4*4，p280-4*8，p280-4*14和pEGFP-C1熒光細(xì)胞陽(yáng)性率值分別為：(4.7±1.30)％，(2.5±0.30)％，(1.8±0.30)％，(0.5±0.30)％，(0.1±0.30)％和(

9、35.3±2.66)％。隨著280-4片段插入數(shù)目增加熒光陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少，p280-4*1熒光陽(yáng)性細(xì)胞率是p280.4*14的47倍(Fig.5)。pAlu1，pAlu2，pAlu4，pAlu8和pAlu14轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的熒光陽(yáng)性率已另文報(bào)道。 Alu和280-4不同插入個(gè)數(shù)的串聯(lián)序列質(zhì)粒和pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，提取RNA，Northern雜交檢測(cè)顯示，隨Alu插入片段增加，轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度增加，轉(zhuǎn)錄量減少。計(jì)算

10、pEGFP-C1/pAlul，pAlul/pAlu2，pAlu2/pAlu4，pAlu4/pAlu8和pAlu8/pAlu14轉(zhuǎn)錄相對(duì)量的比值分別是：1.18，1.14，1.39，1.58和55.5，可見(jiàn)從pAlu8到pAlu14發(fā)生了更加明顯的抑制作用。p280-4*1，p280-4*2，p280-4*4，p280-4*8和p280-4*14質(zhì)粒Northern檢測(cè)結(jié)果為：隨插入片段增加，轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度增加，轉(zhuǎn)錄量減少，抑制程度超過(guò)Alu

11、插入(Fig.6)。 3.SV40Poly解除抑制將PolyA及去除AATAAA核心序列的PolyA按正、反方向插入pAlu14質(zhì)粒的Alu14上游，使A1u14成為基因側(cè)翼，均可以部分解除A1u14對(duì)GFP基因表達(dá)的抑制作用，PolyA反序解除抑制的能力高于其正序，去除AATAAA核心序列的PolyA解除抑制作用基本不變，而且仍然發(fā)生轉(zhuǎn)錄終止；PolyA正、反序列同樣解除ORF2對(duì)GFP基因的抑制作用(Fig.7)。

12、4 280-4與Alu混合排列對(duì)GFP基因表達(dá)的作用pAlul4質(zhì)粒Alul4前按正、反方向插入1，2，4個(gè)280-4，隨著插入片段的增大，轉(zhuǎn)錄減少，插入反序280-4轉(zhuǎn)錄多于正序。280-4串聯(lián)序列反方向插入pEGFP-C1質(zhì)粒，GFP基因轉(zhuǎn)錄多于正序插入，在pAlul4的Alul4的上游插入280-4觀察到類(lèi)似的現(xiàn)象(Fig.8)。 5 DNase Ⅰ消化敏感性pAlu1和pAlu14轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，提取細(xì)胞核，DNase

13、 Ⅰ消化，分別用四對(duì)引物擴(kuò)增，擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為：GFP5F/GFP4R(215bp)，GFP2/GFP3(311bp)；1GFP1F/A1u2(460bp)和ECor-xba/A1u2(340bp)。pAlul4消化1分鐘可擴(kuò)增出特異條帶，消化3分鐘無(wú)擴(kuò)增條帶，而pAlu1轉(zhuǎn)染細(xì)胞核，兩個(gè)消化時(shí)間均無(wú)擴(kuò)增條帶，顯示pAlu14的GFP基因和融合基因?qū)Nase Ⅰ消化的抵抗性高于pAlu1(Fig.9)。 結(jié)論： 1.Al

14、u越長(zhǎng)抑制上游GFP基因的能力越強(qiáng)。 2.Alu屬于轉(zhuǎn)錄延伸序列，不發(fā)生提前終止。 3.L1-ORF2-280-4也屬于轉(zhuǎn)錄延伸序列，但是轉(zhuǎn)錄作用比Alu弱，不發(fā)生提前終止。 4 Alu14和ORF2上游插入PolyA正、反和去除AATAAA的PolyA正、反，使Alu14和ORF2作為基因側(cè)翼序列，對(duì)GFP基因的抑制作用明顯減弱，且不受PolyA正、反序列和去除AATAAA信號(hào)的影響。 5 Alu和28