SHP-1基因的表達(dá)及其對人乳腺癌細(xì)胞磷酸酶活性和增殖的影響.pdf

1、研究背景:
　　 乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位。有資料顯示,其發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7％-10％。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年有120～140萬婦女患乳腺癌,約有50萬患者死于該病。在我國婦女乳腺癌的發(fā)病率也以每年3％的速度逐年遞增。乳腺癌嚴(yán)重影響了女性身心健康,甚至危及生命。如何有效地預(yù)防和治療乳腺癌成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　 隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展,研究者們逐漸認(rèn)識(shí)到在真核細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中,通路蛋白的磷酸化和去磷酸化修

2、飾是信號(hào)通路調(diào)控的重要方式,兩者之間的平衡在細(xì)胞正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。
　　 在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)磷酸化水平方面,酪氨酸激酶及酪氨酸磷酸酶起著非常重要的作用。受體酪氨酸激酶是最大的一類酶聯(lián)受體。目前研究最熱的是表皮生長因子受體家族(也稱為HER家族),包括EGFR、HER2、HER3、HER4。HER家族受體在細(xì)胞膜上以無活性單體存在,一旦與配體結(jié)合,便可彼此結(jié)合形成10種不同的同源二聚體或異源二聚體。二

3、聚體之間相互激活它們的蛋白激酶功能,進(jìn)而激活多種不同的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,導(dǎo)致細(xì)胞增殖等。在乳腺癌患者中,20％～30％的患者存在HER2的高表達(dá),這些HER2高表達(dá)的乳腺癌惡性程度高,易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā),患者的預(yù)后差。目前,針對HER家族的抗腫瘤分子靶向藥物有以EGFR和/或HER2為靶點(diǎn)的藥物主要是TKI(吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼)和單抗類(曲妥珠單抗、西妥昔單抗、尼妥珠單抗等)。雖然TKI的臨床應(yīng)用取得了令人鼓舞的療效,但是多數(shù)治療有效

4、的患者一年內(nèi)出現(xiàn)耐藥。深入研究揭示,HER家族分子間及其它受體分子間的交互激活作用導(dǎo)致HER家族蛋白的激酶活性不能被完全阻斷,細(xì)胞內(nèi)磷酸化水平升高的狀態(tài)不能得到根本改善,是造成耐藥的主要因?yàn)?。其中HER3的活化是其治療逃逸的重要因素。HER3缺乏蛋白激酶活性,但卻具有轉(zhuǎn)磷酸化作用。EGFR、HER2、c-Met等激酶分子可使HER3胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸磷酸化,然后HER3通過其轉(zhuǎn)磷酸化作用直接激活PI3K/Akt等信號(hào)通路。TKI雖可以抑制腫

5、瘤細(xì)胞中EGFR和HER2的自身磷酸化活性,但是HER3的這種轉(zhuǎn)磷酸化活性卻不受抑制,它不是TKI的直接靶點(diǎn)。HER3的存在對小分子靶向藥物治療模式提出了挑戰(zhàn)。探討新的解決思路,勢在必行。
　　 在以PTK為靶點(diǎn)的藥物出現(xiàn)耐藥,治療遇到瓶頸的時(shí)候,我們想到是否可以通過調(diào)控PTP來糾正細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸的過度磷酸化,恢復(fù)細(xì)胞原有的磷酸化平衡,使細(xì)胞維持自身的穩(wěn)定呢? 目前已分離純化的PTPs家族成員有40多個(gè),其中SHP-1基因被認(rèn)為

6、是近年來發(fā)現(xiàn)的重要候選抑癌基因之一,它在造血系統(tǒng)中的抑制白血病細(xì)胞生長的作用已經(jīng)得到了證實(shí)。SHP-1蛋白為含SH2結(jié)構(gòu)域的胞漿非受體酪氨酸磷酸酶,它通過直接去磷酸化作用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白分子酪氨酸的磷酸化水平,抑制細(xì)胞的有絲分裂、增殖、分化和生物活性。我們在前期工作中,分別檢測了30例早期、HER-2陽性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)SHP-1的表達(dá)在HER-2陽性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的標(biāo)本中明顯降低。我們推斷這正是細(xì)胞增殖抑制信號(hào)異常的一種失

7、平衡表現(xiàn)。HER-2表達(dá)升高和SHP-1表達(dá)下降,導(dǎo)致磷酸化及去磷酸化平衡破壞,磷酸化信號(hào)過度活化,細(xì)胞惡性程度及侵襲能力增加。SHP-1主要通過對生長因子受體或非受體蛋白酪氨酸激酶的脫磷酸作用起著重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
　　 目的:
　　 雖然SHP-1蛋白對腫瘤抑制功能已得到肯定,但其在乳腺癌細(xì)胞中的具體作用機(jī)制仍不十分清楚,其底物分子和表達(dá)的調(diào)控機(jī)制等也尚未完全明確。本研究通過轉(zhuǎn)染并表達(dá)SHP-1基因,探討SHP-1

8、蛋白表達(dá)前后細(xì)胞內(nèi)磷酸酶活性的變化及對乳腺癌細(xì)胞的生長活性的影響；構(gòu)建原核表達(dá)載體,BL21大腸桿菌中表達(dá)GST融合蛋白,為下一步打下基礎(chǔ)；構(gòu)建pEGFP-C3-SHP-1 C/S突變載體,觀察轉(zhuǎn)染了 pEGFP-C3-SHP-1和pEGFP-C3-SHP-1 C/S的乳腺癌細(xì)胞內(nèi)磷酸酶活性的不同及細(xì)胞增殖的變化。
　　 方法:
　　 第一章 SHP-1 基因及突變體在真核細(xì)胞中的表達(dá)及活性分析
　　 1.真核熒

9、光表達(dá)載體pEGFP-C3-SHP-1和pEGFP-C3-SHP-1 C/S的構(gòu)建 用HindⅢ、EcoRI對pcDNA3.1(+)-SHP-1重組質(zhì)粒和pEGFP-C3質(zhì)粒進(jìn)行酶切,瓊脂糖凝膠電泳,目的基因膠回收后測定濃度,將SHP-1基因和pEGFP-C3質(zhì)粒的膠回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、鋪板、挑選菌落,卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。行菌液PCR、瓊脂糖凝膠電泳鑒定。選取可見目的基因電泳條帶的菌液樣本繼續(xù)擴(kuò)

10、增培養(yǎng),提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒命名為pEGFP-C3-SHP-1,對其進(jìn)行酶切、電泳等初步鑒定,并經(jīng)廣州英俊公司測序。以pEGFP-C3-SHP-1 為模板,以5'-CATCATCGTGCACAGCAGCGCCGGCA-3’為上游引物,5’-ATGCCGGCGCTGCTGTGCACGATGATG-3’為下游引物,用Stratagene 點(diǎn)突變試劑盒行點(diǎn)突變PCR,將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a,37℃震蕩培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒,命名為pE

11、GFP-C3-SHP-1 C/S,經(jīng)瓊脂糖電泳及廣州英俊公司測序鑒定。
　　 2.pEGFP-C3-SHP-1 和pEGFP-C3-SHP-1 C/S轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株,用Lipofectamine2000介導(dǎo)pEGFP-C3-SHP-1和pEGFP-C3-SHP-1 C/S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 細(xì)胞株后,用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)SHP-1和SHP-1C/S的細(xì)胞克隆。以pEGFP-C3空載

12、體轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞做對照。用于下一步鑒定及生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　 3.SHP-1和SHP-1 C/S基因表達(dá)的鑒定 RT-PCR檢測SHP-1和SHP-1 C/S基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平；Western blot鑒定轉(zhuǎn)染后SHP-1基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。
　　 4.轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)SHP-1和SHP-1 C/S基因的細(xì)胞磷酸酶活性及細(xì)胞增殖能力的變化 將轉(zhuǎn)染了pEGFP-C3-SHP-1和p

13、EGFP-C3-SHP-1 C/S 質(zhì)粒的MDA-MB-231細(xì)胞,以及轉(zhuǎn)染了pEGFP-C3和未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞接種96孔板,培養(yǎng)24h。用無磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞,加入p-NPP作用底物,再加入1mmol/L的NaOH終止反應(yīng),測OD405值。用MTT法檢測轉(zhuǎn)染了SHP-1和SHP-1 C/S基因的乳腺癌細(xì)胞體外增殖能力的變化。
　　 第二章 SHP-1基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)研究
　　 1

14、.原核表達(dá)質(zhì)粒pReceiver-B03-SHP-1的構(gòu)建 將已有的pcDNA3.1(+)-SHP-1重組質(zhì)粒和pReceiver-B03質(zhì)粒用KpnI和XhoI進(jìn)行雙酶切,瓊脂糖電泳后膠回收SHP-1和pReceiver-B03片段,測濃度。將回收片段用T4連接酶連接(16℃,連接過夜)。連接體系轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌,鋪板,37℃孵育過夜。挑選克隆,氨芐抗性LB培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒,酶切、電泳并測序鑒定。將重組質(zhì)粒命名為

15、pReceiver-B03-SHP-1。
　　 2.SHP-1 蛋白原核表達(dá)的鑒定 將轉(zhuǎn)化了pReceiver-B03-SHP-1重組質(zhì)粒和pReceiver-B03空質(zhì)粒的BL21菌液,37℃過夜震蕩培養(yǎng)。分別取上述菌液200ul加入10ml氨芐抗性LB培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)0.6左右。取出上述菌液各5ml,分別加入IPTG至終濃度0.4mM誘導(dǎo)表達(dá),與未加IPTG的菌液共同繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)6hr。分別取出1ml上述

16、菌液(共4個(gè)標(biāo)本),12000rpm離心2min,棄上清,加入1％SDS混勻,煮沸10min,考馬斯亮藍(lán)染色及Western blot鑒定。
　　 結(jié)論:
　　 1.轉(zhuǎn)染了SHP-1和SHP-1 C/S的MDA-MB-231細(xì)胞分別用RT-PCR及Westernblot的方法檢測到SHP-1及SHP-1 C/S基因在mRNA水平和蛋白水平均有表達(dá)。而作為對照的轉(zhuǎn)染了pEGFP-C3空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞

17、中沒有表達(dá)。說明其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功,為下一步實(shí)驗(yàn)做好了前期準(zhǔn)備。
　　 2.轉(zhuǎn)染了pEGFP-C3-SHP-1的MDA-MB-231細(xì)胞的磷酸酶活性明顯增加,而轉(zhuǎn)染了pEGFP-C3-SHP-1 C/S 和pEGFP-C3的MDA-MB-231 細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞在磷酸酶活性活性方面無顯著差異。說明轉(zhuǎn)染的SHP-1基因是具有磷酸酶活性的,而SHP-1 C/S沒有這個(gè)作用。
　　 3.MTT法繪制生

18、長曲線顯示,轉(zhuǎn)染SHP-1基因的MDA-MB-231細(xì)胞其增殖明顯降低,而轉(zhuǎn)染了pEGFP-C3-SHP-1 C/S或pEGFP-C3的MDA-MB-231細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞在細(xì)胞增殖方面無顯著差異。提示SHP-1基因表達(dá)后對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的增殖有抑制作用,而其突變體SHP-1 C/S不具有抑制增殖的作用。
　　 4.轉(zhuǎn)化了原核表達(dá)載體pReceiver-B03-SHP-1的宿主菌BL21在I