慢性乙型肝炎病毒感染對外周血αβT細(xì)胞受體β鏈CDR3譜型的影響.pdf

1、背景 乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是一個全球性公共衛(wèi)生問題。流行病學(xué)資料表明全世界約20億人感染過乙型肝炎病毒。其中約3.5億感染者為慢性HBV感染。近年來隨著HBV轉(zhuǎn)基因鼠模型的建立，已初步證明HBV抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答參與HBV感染引起的肝細(xì)胞損傷過程，并認(rèn)為慢性HBV感染者細(xì)胞免疫功能低下是病毒持續(xù)存在及炎癥反復(fù)活動的主要原因。但是目前所得數(shù)據(jù)中，關(guān)于T細(xì)胞功能及特異性T細(xì)胞頻數(shù)的研究較多，

2、直接針對慢性乙型肝炎患者不同階段及慢性無癥狀HBV攜帶者T細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)特征的研究信息并不多。尤其是關(guān)于病毒載量浮動、抗原濃度變化對機(jī)體T細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)特征的影響了解更少。 目的 1.通過調(diào)查慢性無癥狀HBV攜帶者外周血T細(xì)胞受體譜型的漂移情況，了解T細(xì)胞免疫在其病程中的作用，并探討T細(xì)胞免疫對于慢性無癥狀HBV攜帶者免疫耐受形成機(jī)制的影響。 2.通過分析慢性乙型病毒性肝炎(chronichepatitisB，CHB

3、)炎癥明顯活動期患者T細(xì)胞受體(Tcellreceptor,TCR)互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritiesdeterminingregion，CDR)3譜型的改變，從整體上了解患者T細(xì)胞免疫狀態(tài)，并結(jié)合酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunospotassay，ELISPOT)檢測PBMC中HBcAg特異的rIFN分泌細(xì)胞數(shù)量變化，試圖探討CHB患者肝臟炎癥與T細(xì)胞免疫應(yīng)答、T細(xì)胞CDR3譜系漂移的關(guān)系。

4、 3.通過對CHB患者抗病毒(拉米夫定)治療前后外周血T細(xì)胞TCRCDR3譜型進(jìn)行比較，試圖了解患者在病毒學(xué)應(yīng)答前后其T細(xì)胞免疫應(yīng)答的變化，進(jìn)一步判斷慢性乙型肝炎T細(xì)胞免疫是否在病毒載量下降時有所恢復(fù)，為制訂CHB的抗病毒治療策略提供理論依據(jù)。 4.如果慢性HBV感染后不同個體出現(xiàn)單或寡克隆性增生的T細(xì)胞克隆，我們將試圖對其TCRCDR3區(qū)進(jìn)行基因測序，然后利用分子生物信息軟件比較其核苷酸及氨基酸序列，了解克隆性增生的T細(xì)胞是否

5、具有均一性，并模擬出其TCR可變區(qū)三維空間構(gòu)型，進(jìn)一步探討其TCRCDR3空間結(jié)構(gòu)有無相似性，以期為進(jìn)一步尋找新的HBV抗原表位奠定基礎(chǔ)。 方法 1.設(shè)計(jì)并合成人αβT細(xì)胞TCR24個BV(TCRβchainvariablegene，TCRBV)家族的上游引物和共用的TCRBC(TCRβchainconstantgene，TCRBC)下游引物(FAM標(biāo)記)；在人TCRBC基因中合成實(shí)驗(yàn)對照的TCRBC1、TCRBC2上游

6、引物。 2.PCR擴(kuò)增后，將標(biāo)有FAM熒光的PCR產(chǎn)物在全自動測序儀及6％聚丙烯酰氨變性測序膠上電泳。電泳過程應(yīng)用GeneScan軟件掃描記錄相關(guān)信息并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，了解TCRαβT細(xì)胞CDR3多態(tài)性和長度分布，從而判斷每個BV家族CDR3譜型的漂移情況及單/寡克隆性增生情況。 3.依據(jù)TCRCDR3譜型分析結(jié)果，如有克隆性增生家族存在，則選取部分單/寡克隆增生的TCRBV家族PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行基因測序，利用分子生物信息

7、學(xué)軟件DNAtools6.0及VectorNTISuite8.0分析CDR3區(qū)的序列。 4.采用CPHmodels2.0Serve和IMGT數(shù)據(jù)庫對克隆增生T細(xì)胞TCRCDR3可變區(qū)進(jìn)行三維空間構(gòu)型模擬，并根據(jù)空間結(jié)構(gòu)判斷各克隆性增生T細(xì)胞之間TCRCDR3區(qū)空間結(jié)構(gòu)有無相似性，進(jìn)一步推測克隆增生T細(xì)胞的均一性。 5.慢性無癥狀HBV攜帶者及CHB患者PBMC中HBcAg特異的rIFN分泌細(xì)胞數(shù)檢測應(yīng)用ELISPOT技術(shù)

8、完成，具體按試劑盒說明操作。 結(jié)果 1.4例正常人PBMC中TCR24個BV家族CDR3譜型分析的RT-PCR產(chǎn)物，在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳圖上顯示一條模糊的條帶；在6％的聚丙烯酰氨測序膠電泳圖上，各TCRBV家族均顯示8條以上的條帶 2.9例慢性無癥狀HBV攜帶者外周血TCRBV家族CDR3譜系的RT-PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳時，24個BV家族均可見一條模糊的條帶。6％的聚丙烯酰胺測序膠上電泳時，

9、多數(shù)BV家族可見中間信號強(qiáng)兩邊弱的多個熒光條帶。部分家族呈現(xiàn)單一或兩條較亮的條帶；部分家族呈現(xiàn)非正態(tài)分布的多條亮帶；個別家族沒有收到熒光信號。 3.8例炎癥活動期的慢性乙型病毒性肝炎患者及4例接受拉米夫定抗病毒治療的慢性乙肝患者外周血TCR各BV家族經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳時，24個BV家族同樣也可見模糊的條帶；在6％的聚丙烯酰胺測序膠電泳圖上，多數(shù)TCRBV家族顯示8條以上條帶，部分家族顯示少于8條帶或

10、熒光條帶缺失。 4.依據(jù)相對熒光密度判斷，4例CHB接受拉米夫定治療前，各病例24個BV家族譜型偏移率分別是29.2％(病例1)、37.5％(病例4)、50.0％(病例3)及41.6％(病例2)，均數(shù)為(x)±SD=39.750±8.655。 5.雖然治療前后的譜型偏移率沒有明顯的改變，但通過對各家族治療前后的譜型分析可以看出，4例CHB患者的一些BV家族的TCRCDR3譜型在治療前后發(fā)生了較大變化：部分BV家族治療前為

11、單克隆性增生譜型，治療后恢復(fù)為正態(tài)分布的譜型；部分治療前為多克隆正態(tài)分布譜型，而治療后出現(xiàn)了單/寡克隆性增生。 6.利用CPHmodels2.0Serve和IMGT數(shù)據(jù)庫，對8例慢性乙型肝炎炎癥活動期患者及4例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定治療前后測得的克隆增生T細(xì)胞TCRCDR3區(qū)的蛋白三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬。 7.為進(jìn)一步了解慢性乙型肝炎抗病毒治療后外周血中出現(xiàn)的克隆性增生T細(xì)胞的機(jī)制，我們采用下列兩種方法進(jìn)行了深入研

12、究。 結(jié)論 1.通過TCRCDR3譜型掃描分析，了解到慢性無癥狀HBV攜帶者外周血TCRCDR3譜型存在明顯受限，提示細(xì)胞免疫參與了其病變過程。另外ELISPOT檢測結(jié)果提示慢性無癥狀HBV攜帶者HBcAg特異的rIFN分泌細(xì)胞數(shù)量與正常對照無差別(P＞0.05)。這些結(jié)果進(jìn)一步提示克隆性增生的T細(xì)胞可能與慢性無癥狀HBV攜帶者免疫耐受形成有關(guān)。 2.慢性乙型肝炎炎癥活動期患者的T細(xì)胞譜型分析同樣證實(shí)其外周血TC

13、RCDR3譜型發(fā)生了偏移，且所觀察到的每個病例均有BV家族呈現(xiàn)單/寡克隆性增生。ELISPOT檢測結(jié)果提示慢性乙型肝炎HBcAg特異的rIFN分泌細(xì)胞數(shù)量與正常對照及無癥狀病毒攜帶者相比明顯較高(P＜0.05)，提示CHB患者炎癥活動期克隆性增生T細(xì)胞可能以CTL為主及T細(xì)胞免疫在肝臟炎癥病理中發(fā)揮著重要作用?？寺≡錾腡細(xì)胞TCRCDR3序列測定提示增生的T細(xì)胞不具有均一性，進(jìn)一步提示CHB患者炎癥活動期T細(xì)胞免疫應(yīng)答是多克隆性的。這

14、與慢性乙型肝炎非活動期T細(xì)胞免疫識別較單一抗原表位存在較大差別。 3.通過對慢性乙型肝炎拉米夫定(Lamivudine)抗病毒治療前后TCRCDR3譜型分析，我們可以得出如下結(jié)論：①在拉米夫定抗病毒治療后，患者外周血總的TCRCDR3譜型偏移率改變不大，可能與抗病毒治療后病毒抗原消失時間較短，或一些抗原在短時間內(nèi)未完全消失有關(guān)。②在拉米夫定抗病毒治療后，部分TCRBV家族CDR3譜型發(fā)生了較明顯的改變：一部分BV家族原來的受限譜

15、型恢復(fù)至正態(tài)分布；一些BV家族由原來的正態(tài)譜型轉(zhuǎn)變?yōu)閱?寡克隆性增生或明顯受限譜型。這一結(jié)果提示隨著抗病毒治療取得良好應(yīng)答，細(xì)胞免疫應(yīng)答也發(fā)生了較大的變化，原來活化的T細(xì)胞克隆隨病毒抗原表位消失而失去刺激，最后自行消失。另一方面高載量病毒或高濃度的病毒抗原誘導(dǎo)的部分特異性T細(xì)胞克隆耗竭可能隨著抗病毒治療取得良好應(yīng)答，病毒抗原的下降，使得T細(xì)胞克隆重新得以活化。這些克隆增生的T細(xì)胞可能與慢性乙型肝炎抗病毒治療的應(yīng)答存在著關(guān)系。③治療前后T

16、CRCDR3譜型的變化在一定程度上提示：TCRCDR3免疫掃描分析找到的克隆增生的T淋巴細(xì)胞可能是HBV抗原特異性的，進(jìn)一步說明免疫譜型分析技術(shù)是評價抗原選擇性克隆增生的有效方法之一。④TCRCDR3序列分析及TCR可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)模擬進(jìn)一步證實(shí)治療前后克隆性增生的T細(xì)胞并非由同一抗原表位引起的，進(jìn)一步提示抗病毒治療細(xì)胞免疫發(fā)生的變化。總之這一結(jié)果對我們制訂慢性乙型肝炎抗病毒策略可能會有所啟示。 4.通過PCR及克隆測序證實(shí)CHB