中國(guó)水仙NtSAMT基因的克隆及轉(zhuǎn)化金魚藤的研究.pdf

1、中國(guó)水仙(Narcissus tazetta var.Chinensis Roem)為石蒜科(Amaryllidaceae)水仙花屬多年生球根花卉，是中國(guó)十大名花之一。花瓣清新淡雅，香氣濃郁。金魚藤(Asarina procumbens)是玄參科金魚藤屬多年生草本花卉，向左纏繞生長(zhǎng)，是良好的垂直綠化的植物材料，原產(chǎn)于歐洲，花色豐富，花和葉都有一定的觀賞價(jià)值，但是其缺少香味?；ㄏ闶谴紊x產(chǎn)物的一種，由大量的揮發(fā)性物質(zhì)混合而成，以揮發(fā)的形

2、式散布到環(huán)境中?；ㄏ憧梢蕴嵘龍@林植物的觀賞價(jià)值，另一方面可以吸引昆蟲授粉，通過雜交培育新品種。萜烯類化合物和苯丙酸類化合物/苯環(huán)型化合物的代謝途徑是目前主要研究的兩個(gè)花香代謝途徑。研究表明，通過引入外源花香物質(zhì)合成相關(guān)基因，使轉(zhuǎn)基因植株花香品質(zhì)改變是可行的。SAM基因是苯丙氨酸代謝途徑中重要的催化酶，能夠調(diào)節(jié)花香成分中水楊酸甲酯的釋放。本研究利用分子遺傳手段，克隆中國(guó)水仙中調(diào)控花香合成的NtSAM基因，分析該基因的結(jié)構(gòu)和功能，用農(nóng)桿菌介

3、導(dǎo)法將NtSAM基因轉(zhuǎn)化到金魚藤中，從而改良金魚藤花香品質(zhì);同時(shí)為觀賞植物進(jìn)行花香遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。
　　本研究以中國(guó)水仙(Narcissus tazetta var.Chinensis Roem)盛花期花瓣為材料，克隆得到中國(guó)水仙中NtSAMT全長(zhǎng)基因，采用DNAMAN軟件對(duì)其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，構(gòu)建了1個(gè)以CaMV35S為啟動(dòng)子的pBI121植物表達(dá)載體。建立了金魚藤的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)

4、化金魚藤，將NtSAMT導(dǎo)入金魚藤中，通過PCR檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)對(duì)抗性植株進(jìn)行鑒定，確定最終得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。
　　主要結(jié)果歸納如下:
　　(1)通過RT-PCR克隆得到了NtSAMT基因的cDNA全長(zhǎng)序列，該基因cDNA序列全長(zhǎng)（包含引物）共1269bp，開放閱讀框?yàn)?131bp，共編碼376個(gè)氨基酸，與GenBank登錄號(hào)為AFR23078的中國(guó)水仙氨基酸數(shù)量相同，有99.2％的同源性，H20與Y20、L62與S

5、62、L143與F1433個(gè)氨基酸殘基存在差異。
　　(2)運(yùn)用DNAMAN軟件分析表明，其蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為42.46kD，等電點(diǎn)(pI)為5.11，與其他植株的氨基酸序列的同源性在41.6％～47.2％之間。分子進(jìn)化樹表明，新克隆的中國(guó)水仙花香基因SAM編碼的氨基酸序列與GenBank登錄號(hào)為AFR23078的中國(guó)水仙氨基酸序列為相同的聚類分支，但是和其余植物的SAM基因氨基酸序列的同源性相對(duì)較小。
　　(3)建立了農(nóng)

6、桿菌介導(dǎo)金魚藤的遺傳轉(zhuǎn)化體系。以莖段作為轉(zhuǎn)化材料，誘導(dǎo)愈傷組織預(yù)培養(yǎng)10d;農(nóng)桿菌侵染液OD600值為0.5～0.6，侵染15min;避光共培養(yǎng)3d，初代篩選培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/L NAA+0.3mg/L KT+20mg/L Km+350mg/L Cef;繼代篩選培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+60mg/L Km+350mg/L Cef;誘導(dǎo)根分化時(shí)，篩選培養(yǎng)基為MS+150m