中國(guó)水仙花型、花色發(fā)育基因(NTMADS1、NtMADS3、NTPDS1和NTPZDS1)的克隆與轉(zhuǎn)化.pdf

1、中國(guó)水仙（Narcissus tazetta var．chinensis）是世界著名的球根花卉，也是我國(guó)傳統(tǒng)名花中出口創(chuàng)匯的重要種類。由于中國(guó)水仙是同源三倍體，利用傳統(tǒng)的雜交和實(shí)生選種方法產(chǎn)生新品種存在極大困難，加之野生資源高度匱乏，致使中國(guó)水仙品種單一成為我國(guó)水仙產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題?？寺∨c中國(guó)水仙花型和花色發(fā)育相關(guān)的功能基因，建立優(yōu)化的中國(guó)水仙遺傳轉(zhuǎn)化體系，不僅可以在一定程度上揭示中國(guó)水仙花型和花色的變異機(jī)理，還可為利用植物基因工程改

2、良中國(guó)水仙的觀賞性狀提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。本研究對(duì)中國(guó)水仙的兩個(gè)MADS-box基因（NTMADS1和NtMADS3）、兩個(gè)花色發(fā)育基因（NTPDS1和NTZDS1）和遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了研究，主要結(jié)論如下：
　　1、利用RT-PCR技術(shù)，從中國(guó)水仙‘玉玲瓏’幼嫩花序中克隆到NTMADS1基因，序列分析表明，NTMADS1 cDNA片段總長(zhǎng)為879 bp，含有完整的開(kāi)放閱讀框架，編碼230個(gè)氨基酸。與擬南芥MADS-box基因家族

3、的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，該基因?qū)儆贏G亞族的C類功能基因。利用RT-PCR方法，研究了NTMADS1基因在開(kāi)花期的組織特異表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)NTMADS1基因只在中國(guó)水仙花中表達(dá)，且豐度極高；在花的雄蕊中表達(dá)量最高，其次為副冠、雌蕊，在花瓣中幾乎未檢測(cè)到該基因表達(dá)。以pBI121為載體，構(gòu)建了該基因的正義表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法和蘸花法，將構(gòu)建好的基因分別在煙草和擬南芥中異位表達(dá)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)NTMADS1基因的

4、擬南芥植株開(kāi)花期明顯早于野生型，且花型出現(xiàn)顯著變化，如雄蕊心皮狀、花瓣全部或部分退化、頂部莖生葉出現(xiàn)花狀結(jié)構(gòu)等。轉(zhuǎn)基因煙草則出現(xiàn)花冠裂片變短且邊緣不規(guī)則、花筒開(kāi)裂、花藥退化等現(xiàn)象。初步表明NTMADS1參與了花型和花期的調(diào)控。
　　2、利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從中國(guó)水仙‘金盞銀臺(tái)’幼嫩花序中克隆到NtMADS3基因，序列分析表明，NtMADS3 cDNA總長(zhǎng)為980 bp，含有一個(gè)726 bp的完整ORF，編碼241個(gè)氨基

5、酸。與擬南芥MADS-box基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，該基因與擬南芥(A. thaliana)的AGL6親緣關(guān)系最近，屬于E類功能基因。利用RT-PCR方法分析了該基因在開(kāi)花期的組織特異表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn) NtMADS3基因在中國(guó)水仙開(kāi)花期的花、葉片、鱗片和根系中以及花的各個(gè)部位均有表達(dá)。將構(gòu)建在pBI121載體上的NtMADS3基因在煙草和擬南芥中異位表達(dá)，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn) NtMADS3基因擬南芥植株開(kāi)花期明顯早于野

6、生型，但花型未出現(xiàn)顯著變化；部分轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)植株矮小和蓮座葉卷曲現(xiàn)象，但絕大部分表現(xiàn)正常。轉(zhuǎn)基因煙草則出現(xiàn)花筒開(kāi)裂、雄蕊退化或瓣化等現(xiàn)象。初步表明NtMADS3基因參與了花期和花型的調(diào)控。
　　3、從中國(guó)水仙‘金盞銀臺(tái)’幼齡花序中克隆到中國(guó)水仙八氫番茄紅素脫氫酶（NTPDS1）基因和ζ-胡蘿卜素脫氫酶（NTZDS1）基因。序列分析表明，NTPDS1 cDNA片段總長(zhǎng)為1719 bp，含有完整的開(kāi)放閱讀框架，可編碼含570個(gè)氨基酸

7、；NTZDS1基因總長(zhǎng)為1899 bp，ORF可編碼574個(gè)氨基酸。兩個(gè)基因均在中國(guó)水仙的花中大量表達(dá)，且在花瓣和副冠中的表達(dá)量高于雄蕊和雌蕊；葉片和根中的表達(dá)量次之；在鱗片中表達(dá)量極少或檢測(cè)不到表達(dá)。構(gòu)建了兩個(gè)基因的pBI121和pCAMBIA1300植物表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌將上述基因轉(zhuǎn)入煙草和擬南芥中，得到了卡那抗性的再生植株。
　　4、以中國(guó)水仙不同部位外植體進(jìn)行了不定芽直接分化和愈傷組織誘導(dǎo)分化試驗(yàn)，結(jié)果表明，雙鱗片外植

8、體在MS0＋6-BA10.0 mg/L＋NAA1.0 mg/L＋蔗糖40 g/L＋瓊脂7.5 g/L培養(yǎng)基上可以大量地直接再生，再生芽數(shù)量平均可達(dá)13～16個(gè)/cm雙鱗片，比傳統(tǒng)的鱗莖盤之間分化提高30~50％；鱗片、葉片、花葶及花部不同組織在適宜的配方中均可不同程度地誘導(dǎo)出愈傷組織，但以帶花藥的花絲誘導(dǎo)出的愈傷組織最好。篩選抗生素和抑菌抗生素濃度試驗(yàn)表明，花絲產(chǎn)生的愈傷組織的選擇壓為潮霉素15~20 mg/L；羧芐青霉素的抑菌濃度為2