枳PtrICE1、PtrHOS1和PtrLOS2基因克隆及PtrICE1遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、柑橘的周期性凍害在世界范圍內(nèi)時(shí)有發(fā)生,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗寒基因?qū)敫涕僭耘嗥贩N中表達(dá)是縮短育種周期,快速獲得柑橘抗寒品種的有效途徑之一。但是目前有關(guān)柑橘抗寒基因克隆的研究很少,這種情況嚴(yán)重限制了柑橘抗寒分子育種的進(jìn)展。
　　 本研究從柑橘的抗寒近緣種枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)中克隆出了柑橘冷響應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控途徑中的3個(gè)關(guān)鍵基因PtrICE1、PtrHOS1和PtrLOS2,

2、同時(shí)對(duì)它們進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析,研究了它們?cè)诓煌h(huán)境脅迫下在枳中的時(shí)空表達(dá)模式。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)鑒定了其中一個(gè)編碼上游轉(zhuǎn)錄因子的基因PtrICE1的功能,證明了在模式植物煙草中超量表達(dá)PtrICE1能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性。然后克隆出了PtrICE1的上游啟動(dòng)子序列,并且通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)初步證明該啟動(dòng)子具有一定的冷響應(yīng)和機(jī)械損傷響應(yīng)活性。本研究為最終通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗寒性強(qiáng)的柑橘栽培品種提供了新的基因資源和理論基礎(chǔ)。本研究獲得的主

3、要結(jié)果如下:
　　 1.從枳中克隆出了一個(gè)bHLH(basic Helix-Loop-Helix)家族基因PtrICE1,該基因長(zhǎng)1933 bp,包含一個(gè)1464 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼487個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為53.6 kDa,等電點(diǎn)為5.30。PtrICE1蛋白與其它植物ICE1家族蛋白的氨基酸序列一致性很高,并且具有保守的SUMO(small ubiquitin-relatedmodifier)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、b

4、HLH結(jié)構(gòu)域和C-末端區(qū)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果表明,植物ICE1家族蛋白可分為雙子葉植物類和單子葉植物類兩大類,PtrICE1屬于雙子葉植物類。
　　 2.在正常的生長(zhǎng)條件下,PtrICE1在枳根、莖、葉中都有一定程度的表達(dá)。冷處理之后,枳葉和莖中PtrICE1表達(dá)先上調(diào)后下調(diào),在根中表達(dá)先下調(diào)后上調(diào)。ABA處理之后,枳葉、莖、根中PtrICE1表達(dá)都是先上調(diào)后下調(diào)。這些結(jié)果說(shuō)明冷處理和ABA處理都能影響枳不同器官中PtrIC

5、E1的表達(dá)。
　　 3.構(gòu)建了PtrICE1的超量表達(dá)載體pMVICE1,并通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將pMVICE1導(dǎo)入模式植物煙草中,使PtrICE1在煙草中超量表達(dá)。通過(guò)PCR檢測(cè)獲得了17個(gè)陽(yáng)性T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株。T0代轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)速度比野生型煙草慢,開(kāi)花時(shí)間比野生型煙草推遲10 d左右,開(kāi)花以后兩者的表型差異不大。
　　 4.T0代轉(zhuǎn)基因煙草果實(shí)成熟后收集種子,經(jīng)Km抗性篩選后獲得陽(yáng)性T1代轉(zhuǎn)基因煙草。通

6、過(guò)比較T1代轉(zhuǎn)基因和野生型煙草在冷處理后的相對(duì)電導(dǎo)率、成活率以及表型后發(fā)現(xiàn),與野生型煙草相比,T1代轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率更低,成活率更高,并且常溫處理之后能夠恢復(fù)生長(zhǎng),說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性比野生型更強(qiáng),因此我們認(rèn)為在植物中超量表達(dá)PtrICE1能夠提高植物的抗寒性。
　　 5.本研究克隆出了PtrICE1基因的DNA序列。通過(guò)比較PtrICE1編碼區(qū)的DNA和cDNA序列發(fā)現(xiàn),PtrICE1含有四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子。采用p

7、MD18-T載體介導(dǎo)的接頭PCR方法克隆了PtrICE1基因的上游啟動(dòng)子序列,并采用PLACE程序?qū)trICE1啟動(dòng)子上可能存在的順式作用元件進(jìn)行了分析,結(jié)果找到一些與植物抗逆性相關(guān)的順式作用元件,其中包括冷響應(yīng)元件(CRT/DRE、MYC)、光響應(yīng)元件(GT1、GATA)、脫水和ABA響應(yīng)元件(ABRE、MYB)和各種激素響應(yīng)元件(ARF、ASF、GARE、WBOX等)。
　　 6.本研究構(gòu)建了能夠檢測(cè)PtrICE1啟動(dòng)子活

8、性的表達(dá)載體pBIPROICE1:GUS。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將pBIPROICE1:GUS導(dǎo)入模式植物煙草中,并通過(guò)PCR檢測(cè)獲得了陽(yáng)性的T0代轉(zhuǎn)基因煙草。T0代轉(zhuǎn)基因煙草葉片的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明,野生型煙草葉片未出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn),而未經(jīng)冷處理時(shí)轉(zhuǎn)基因煙草葉片表面只出現(xiàn)了少量的藍(lán)色斑點(diǎn),但在葉片切口處染色較深。4℃冷處理之后,轉(zhuǎn)基因煙草葉片上藍(lán)色斑點(diǎn)的數(shù)量增加,且在葉片傷口處染色較深,說(shuō)明PtrICE1啟動(dòng)子具有冷響應(yīng)和機(jī)械

9、損傷響應(yīng)活性。
　　 7.從枳中克隆出了PtrHOS1基因,該基因長(zhǎng)3434bp,包含一個(gè)2922 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼974個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為110.2 kDa,等電點(diǎn)為5.55。PtrHOS1蛋白與其它植物HOS1類似蛋白的氨基酸序列一致性很高,并且在PtrHOS1蛋白的N末端含有一個(gè)高度保守的環(huán)指結(jié)構(gòu)域(RING finger domain)。植物HOS1類似蛋白可分為雙子葉植物類和單子葉植物類兩大類,PtrHOS

10、1屬于雙子葉植物類。在正常的生長(zhǎng)條件下,PtrHOS1在枳根、莖、葉中表達(dá)強(qiáng)烈,冷處理和ABA處理之后,在枳的根、莖、葉中PtrHOS1的表達(dá)都出現(xiàn)了暫時(shí)的下調(diào),說(shuō)明在枳的根、莖、葉中PtrHOS1的表達(dá)都受冷處理和ABA處理的下調(diào)調(diào)控。
　　 8.從枳中克隆出了PtrLOS2基因,該基因長(zhǎng)1662 bp,包含一個(gè)1338 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼445個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為47.79 kDa,等電點(diǎn)為5.54。PtrLOS2蛋

11、白與擬南芥LOS2蛋白及其它植物烯醇酶的氨基酸序列一致性很高(超過(guò)86％),說(shuō)明PtrLOS2很可能編碼一種烯醇酶。PtrLOS2含有兩個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域,它們分別是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域。在正常的生長(zhǎng)條件下,PtrLOS2在枳根、莖、葉中都有表達(dá),枳根和莖中PtrLOS2的表達(dá)量要高于葉中。從總體上來(lái)說(shuō),經(jīng)過(guò)冷處理后,枳葉片和莖中PtrLOS2的表達(dá)是先上調(diào)后下調(diào),而在根中PtrLOS2的表達(dá)是下調(diào)的。ABA處理之后,枳葉片