芍藥泛素和乙烯受體基因的克隆、分析及PlETR1煙草轉(zhuǎn)化.pdf

1、芍藥（Paeonia lactifloraPall.）為芍藥科芍藥屬花卉，是我國傳統(tǒng)名花。但是，芍藥與其它鮮切花一樣，會(huì)隨著花朵的開放迅速衰老。乙烯，作為一種植物激素，在植物生長和發(fā)育過程中起著重要作用，并調(diào)控花衰老?；ǘ湟蚁┧降脑黾优c花衰老相關(guān)。本研究克隆了芍藥品種‘桃花飛雪’的乙烯受體基因家族成員、分析其表達(dá)水平并進(jìn)行了 PlETR1基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化。另外，本研究開發(fā)了一種新的PCR技術(shù)：引物池-隨機(jī)引物對PCR，使用該技術(shù)克隆

2、到7個(gè)芍藥泛素基因。研究結(jié)果如下：
　?。?）通過RT-PCR獲得芍藥3條乙烯受體基因相關(guān)序列，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中借助RACE PCR技術(shù)獲得的1條乙烯受體基因相關(guān)序列，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這4條非冗余序列編碼的多肽鏈分別為擬南芥AtETR1、AtETR2、AtERS1和AtEIN4的同源序列，因而將這4個(gè)推測的基因命名為 PlETR1、PlETR2、PlERS1和PlEIN4。克隆獲得的芍藥PlETR1、PlETR2、PlE

3、RS1和PlEIN4DNA片段長度分別為2817bp、2286bp、2016bp和2295bp，依次編碼740、761、633和764個(gè)氨基酸，核酸序列GenBank登錄號(hào)為JX406435、KP265306、KP265307和KP265308。生物信息學(xué)分析表明PlETR1、PlETR2和PlERS1的N端3次跨膜，PlEIN4的N端4次跨膜。結(jié)構(gòu)域分析顯示這4個(gè)乙烯受體均具有GAF、HisKA和 HATPase_c3個(gè)典型的乙烯受體

4、結(jié)構(gòu)域，PlETR1、PlETR2和PlEIN4具有REC結(jié)構(gòu)域，而PlERS1無此結(jié)構(gòu)域。
　　以芍藥花瓣不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)最穩(wěn)定的Actin2作為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析這4個(gè)受體在芍藥開花指數(shù)1～6級(jí)時(shí)的花瓣中的表達(dá)水平，結(jié)果表明：芍藥乙烯受體的不同家族成員的表達(dá)模式和表達(dá)水平不同，PlETR1在1～5級(jí)花瓣中的表達(dá)模式呈“V”形，6級(jí)時(shí)仍然維持在較高水平；PlETR2在花瓣發(fā)育的6個(gè)階段表達(dá)量都很低；PlER

5、S1和PlEIN4在芍藥花發(fā)育的6個(gè)階段表達(dá)模式相似，在2級(jí)時(shí)的最低，6級(jí)時(shí)的最高，變化趨勢都是從1級(jí)時(shí)的較高水平先下降后上升，再下降，隨之上升到6級(jí)時(shí)的最高水平，整體的變化趨勢近似“W”形。不同乙烯受體的差異表達(dá)模式表明芍藥花瓣對乙烯具有復(fù)雜的響應(yīng)機(jī)制。
　?。?）以cDNA為模板，擴(kuò)增 PlETR1序列，將其連接到過表達(dá)載體pCambia1301-UbiN上并將重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。遺傳轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因能夠代謝

6、潮霉素B，因而轉(zhuǎn)基因成功的植株具有潮霉素B抗性。農(nóng)桿菌侵染的煙草葉片接種到潮霉素選擇培養(yǎng)基上，將煙草葉片愈傷組織分化形成的幼苗種在蛭石-草炭土基質(zhì)中，幼苗長大后在DNA和RNA水平檢測目的基因。本研究通過PCR確定PlETR1已經(jīng)整合到煙草的基因組DNA上，并且借助RT-PCR確定PlETR1在煙草葉片中轉(zhuǎn)錄出RNA。
　?。?）IlluminaHiSeq?2000測序平臺(tái)獲得的Reads（直接測序獲得的序列）較短，很難對高同源性

7、多基因家族（如泛素基因家族）成員進(jìn)行正確拼接。為了獲得正確且完整的編碼區(qū)序列（Coding sequence，CDS），可從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分離含有5'和3'非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR）的同一基因家族成員相關(guān)序列，在UTR區(qū)分別設(shè)計(jì)上下游引物F（Forward primer）和R（Reverse primer），將所有F混合在一起構(gòu)成F池，所有R構(gòu)成R池。混合F池和R池組成總引物池，理論上通過一次PCR就能將P

8、CR反應(yīng)液中含有上下游引物的所有序列擴(kuò)增出來，這樣的PCR可被稱為總引物池PCR（Totalprimed poolPCR，Total ppPCR）。做完總引物池PCR之后，將F池與R分別組合或R池與F分別組合，所執(zhí)行的PCR分別被稱為F池PCR（F-Pool PCR）和R池PCR（R-Pool PCR）。然后，將電泳后有條帶的F池和R池PCR對應(yīng)的R與F隨機(jī)組合進(jìn)行PCR（隨機(jī)引物對PCR，Arbitrarily primedpair

9、PCR，appPCR），再將擴(kuò)增獲得的條帶回收并測序。引物池和隨機(jī)引物對PCR合稱為引物池-隨機(jī)引物對PCR（Primed poolandarbitrarily primedpairs PCR，pp-appPCR），該技術(shù)適用于克隆已獲得5'和3' UTR序列并且無法通過拼接得到完整CDS的情況，用于分離高同源性多基因家族成員。
　　從芍藥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分離出12條含有5'UTR和11條含有3'UTR的泛素基因（Ubiquitin，

10、UBQ）序列，在UTR區(qū)設(shè)計(jì)引物，可組合成1個(gè)總引物池、12個(gè)R池和11個(gè)F池。隨機(jī)引物對PCR擴(kuò)增出8條帶，將測序后的序列命名為UBQ1-UBQ8，生物信息學(xué)分析測序結(jié)果表明：UBQ3和UBQ8為同一序列且UBQ1至UBQ7兩兩間非冗余，7條序列均為泛素基因，含有完整CDS，其GenBank登錄號(hào)分別為KT203772.1、KP645374.1、KP708576.1、KP708577.1、KT203773.1、KP708578.1和K