檉柳泛素交聯(lián)酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化及抗逆性分析.pdf

1、本研究將從極度抗旱、耐鹽植物檉柳(Tamarixandrossowii)中克隆得到的泛素交聯(lián)酶基因(ubiquitinconjugatingenzymesE2s)，成功構(gòu)建到植物表達(dá)載體pROKⅡ上，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將泛素交聯(lián)酶基因?qū)肽Ｊ街参餆煵莼蚪M中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的鹽、旱脅迫試驗(yàn)，對(duì)泛素交聯(lián)酶基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。 對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得68株卡那霉素抗性芽，從中選出長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)的15個(gè)株系，進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性；

2、從15個(gè)株系中隨機(jī)對(duì)6個(gè)株系進(jìn)行PCR-Southem雜交，各轉(zhuǎn)基因株系均出現(xiàn)雜交譜帶，證明泛素交聯(lián)酶基因已整合到煙草基因組中；進(jìn)一步對(duì)6個(gè)株系進(jìn)行RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明外源基因能夠表達(dá)，但各株系外源基因的表達(dá)水平不盡相同，表達(dá)量最高的為TL3和TL1，TL10和TL11次之、最低的為TL5和TL7。 分別對(duì)6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了NaCl脅迫和干旱脅迫試驗(yàn)，分析逆境脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢?/p>

3、草的丙二醛(MDA)含量、相對(duì)電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶(SOD)活性、葉綠素含量、相對(duì)生長(zhǎng)量、生根率等指標(biāo)的變化，結(jié)果表明，不同濃度NaCl脅迫處理后，各株系的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量都逐漸增大，在NaCl濃度為440mmol.L-1時(shí)，各轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)電導(dǎo)率平均值低于對(duì)照煙草的27.1％，MDA平均含量低于對(duì)照的22.6％；NaCl脅迫下，各轉(zhuǎn)基因株系SOD平均活性最低的TL5也高于對(duì)照煙草的47.5％，葉綠素平均含量最高的TL10高于對(duì)

4、照煙草的64.4％，最低TL3也高于對(duì)照煙草的29.7％；當(dāng)NaCl濃度220mmol.L-1時(shí)對(duì)照煙草生根率只有30％，而轉(zhuǎn)基因煙草生根率保持在50～70％，綜上說(shuō)明，鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草受害程度明顯小于對(duì)照。 干旱脅迫處理10d時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)電導(dǎo)率平均值低于對(duì)照煙草的19.6％；對(duì)照煙草MDA含量為7.7umol.g-1，而轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量大多在4.9～6.3μmol.g-1左右，低于對(duì)照煙草；此時(shí)轉(zhuǎn)基因煙草的葉

5、綠素平均含量為1.01mg.g-1，高于對(duì)照的64.5％，而SOD平均活性高于對(duì)照的32.3％；對(duì)轉(zhuǎn)基因株系干旱脅迫10d時(shí)相對(duì)生長(zhǎng)量進(jìn)行調(diào)查，各轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)生長(zhǎng)量在59％～83％范圍之間，而對(duì)照株系的相對(duì)生長(zhǎng)量為29.7％，說(shuō)明泛素交聯(lián)酶基因的導(dǎo)入提高了煙草的抗旱能力。 綜合以上結(jié)果，泛素交聯(lián)酶基因的組成型表達(dá)能夠不同程度提高轉(zhuǎn)基因煙草逆境脅迫下細(xì)胞膜穩(wěn)定性、SOD活性、葉綠素含量及相對(duì)生長(zhǎng)量，說(shuō)明泛素交聯(lián)酶基因具有提高植物