冬小麥GNA和幾丁質(zhì)酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、選用89-27、中88375、919-18-4、咸農(nóng)四號等4個甘肅地區(qū)大面積種植的、品質(zhì)較好、性狀優(yōu)良的冬小麥品種作為基因轉(zhuǎn)化的受體材料.用其幼胚、幼穗、成熟胚作為外植體進行離體培養(yǎng),研究了不同外植體、基因型對愈傷組織形成及分化的影響,并且分析了取材時期、激素配比和預處理等有關(guān)因素的影響,建立了較好的遺傳轉(zhuǎn)化體系.在此基礎上,采用基因槍法、花粉管通道法、浸泡愈傷組織及浸種法等4種方法將帶有幾丁質(zhì)酶基因和帶有GNA基因的質(zhì)粒同時或單獨轉(zhuǎn)入

2、小麥細胞,最終得到了轉(zhuǎn)基因候選植株,移栽入大田進行抗蟲、抗病試驗.主要結(jié)果如下:(1)外植體來源對于愈傷組織誘導和生長、植株再生和遺傳轉(zhuǎn)化的成功與否影響極大.在所用的3種小麥外植體中,幼胚表現(xiàn)最好,幼穗次之.(2)成熟胚愈傷組織的誘導使用4mg/L的2,4-D濃度較為有利,在MS+6-BA 2.0+NAA 0.5+KT 1.0培養(yǎng)基上分化率較高.低溫及CaCl<,2>預處理對成熟胚愈傷組織的影響與小麥品種有關(guān).幼胚及幼穗愈傷組織的最適分

3、化培養(yǎng)基因不同品種而異;(3)利用基因槍技術(shù),將帶有幾丁質(zhì)酶基因的質(zhì)粒(pCAM BAR.chill或pZ100)和帶有GNA基因的質(zhì)粒(pGNA-hyg)同時導入4個小麥品種的幼胚、幼胚愈傷組織及幼穗愈傷組織.(4)利用花粉管通道法,將帶有GNA基因的質(zhì)粒pBI121SSGNA導入4個小麥品種,對26株T1代田間抗性表現(xiàn)較好的T2代植株進行了PCR檢測,8株呈陽性,初步證明了外源抗性基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入小麥植株;

4、(5)用愈傷組織浸泡法,將帶有GNA基因的pGNA-hyg質(zhì)粒導入2個小麥品種,其中咸農(nóng)四號獲得11株再生植株.PCR檢測在3株小麥中檢測到目的基因,平均轉(zhuǎn)化頻率為0.75﹪;(6)利用種子浸泡法,將帶有幾丁質(zhì)酶基因的pZ100質(zhì)粒和帶有GNA基因的pGNA-hyg質(zhì)粒同時導入4個小麥品種,經(jīng)過篩選,919-18-4和咸農(nóng)四號共獲得抗性植株5株,PCR檢測顯示1株呈nptII基因陽性,3株呈GNA基因陽性,1株呈雙陽性,平均轉(zhuǎn)化頻率分別