苦瓜幾丁質(zhì)酶-益母草抗菌肽雙價基因（CHI-AFP）遺傳轉(zhuǎn)化玉米的研究.pdf

1、玉米是現(xiàn)代食品、飼料、醫(yī)藥及化工的主要原料作物。2006年我國玉米種植面積達(dá)到2690萬公頃，約占我國耕地總面積的20％。病蟲害尤其是真菌病害是影響玉米產(chǎn)量及品質(zhì)的主要因素之一，每年真菌病害造成的損失高達(dá)總產(chǎn)量的10-20％，甚至更多。目前防治真菌病害的方法主要以化學(xué)藥物防治為主，其成本高，且真菌易產(chǎn)生抗藥性，造成環(huán)境污染。培育抗病品種無疑是最經(jīng)濟有效的方法，但玉米抗性資源比較缺乏，且常規(guī)育種耗時費力，利用基因工程技術(shù)對玉米品種進(jìn)行定向

2、改良，是獲得抗病品種的快捷、有效途徑。幾丁質(zhì)酶可分解真菌細(xì)胞壁重要組成成分幾丁質(zhì)，抑制真菌的生長和增殖，從而起到防御病原真菌的作用；抗菌肽是一類新型的抗菌物質(zhì)，其抗菌譜廣、抗菌活性高。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍兩種方法將含有單價苦瓜幾丁質(zhì)酶基因(CHI)及其與益母草抗菌肽基因(AFP)的雙價表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化玉米，得到如下結(jié)果： 1、研究了不同大小幼胚對愈傷誘導(dǎo)率及愈傷質(zhì)量的影響。結(jié)果表明1.0-2.0mm的幼胚愈傷組織誘導(dǎo)頻率

3、高達(dá)90％以上且誘導(dǎo)的愈傷質(zhì)量較好：生根培養(yǎng)基中附加2mg·L<'->多效唑不僅能促進(jìn)生根，且植株健壯，易于移栽成活。 2、優(yōu)化了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米的因素。探討了預(yù)培養(yǎng)、侵染時間、不同濃度乙酰丁香酮和篩選方式對轉(zhuǎn)化效率的影響，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化受體采用預(yù)培養(yǎng)6-9d的處于旺盛分裂期的胚性愈傷；侵染時間為10min；重懸液和共培養(yǎng)基均附加100μM的乙酰丁香酮；延遲1周篩選，在此參數(shù)下轉(zhuǎn)化效率達(dá)24.25％；比較基因槍法轉(zhuǎn)化中轟擊

4、距離對轉(zhuǎn)化的影響，發(fā)現(xiàn)轟擊距離為9cm較為適合玉米轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)到35％左右。 3、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定GUS染色鑒定：取抗性愈傷和轉(zhuǎn)化植株的葉片進(jìn)行GUS染色，均出現(xiàn)了藍(lán)色，表明GUS基因已經(jīng)導(dǎo)入并表達(dá)。PCR鑒定：提取轉(zhuǎn)化植株和對照植株葉片基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，轉(zhuǎn)化植株擴增出401bp大小的目的片段而對照植株則無，進(jìn)一步說明目的基因已整合至植物基因組DNA。除草劑抗性鑒定：取轉(zhuǎn)基因和對照植株葉片插入含除草劑草丁膦為200m