E2泛素交聯(lián)酶RAD6在人類細(xì)胞周期中調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束開始到下一次分裂結(jié)束，由一個(gè)細(xì)胞分裂為兩個(gè)相同子細(xì)胞的過程，是細(xì)胞最基本的反應(yīng)。要保證整個(gè)分裂過程的精確性，就必須對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程中相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行精確的調(diào)控，以確保細(xì)胞周期中各個(gè)事件的有序運(yùn)行。在細(xì)胞內(nèi)，有一系列的機(jī)制調(diào)控著整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的正常運(yùn)行，而蛋白的泛素化修飾便是其中至關(guān)重要的一環(huán)。
　　蛋白的泛素化修飾在蛋白質(zhì)的降解和功能調(diào)節(jié)中起著重要的作用。泛素化修飾過程一般需要三類酶來參與，分

2、別是E1泛素激活酶、E2泛素交聯(lián)酶以及E3泛素-蛋白連接酶。這三類酶協(xié)同作用，可以為特定的蛋白質(zhì)底物打上不同形式的泛素化修飾（單泛素化或者多泛素化）?，F(xiàn)在，人們對(duì)于蛋白質(zhì)的多泛素化修飾已經(jīng)有了足夠深入的了解，普遍認(rèn)為多泛素化修飾一般會(huì)導(dǎo)致底物蛋白質(zhì)的降解。生物體內(nèi)折疊異常或者功能執(zhí)行完畢的蛋白質(zhì)會(huì)先被打上多泛素化的標(biāo)簽，然后通過“泛素-蛋白酶體”途徑被降解掉。單泛素化修飾對(duì)蛋白質(zhì)的影響往往比較復(fù)雜，它一般不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)底物的降解，而是對(duì)

3、其生物學(xué)功能有著重要的調(diào)控作用。RAD6就是一種相當(dāng)重要的E2泛素交聯(lián)酶，它廣泛地參與到諸如DNA損傷修復(fù)、組蛋白修飾以及基因表達(dá)等多種生物學(xué)過程中。
　　本研究首先在人類肝臟細(xì)胞HL-7702中對(duì)RAD6分別進(jìn)行過表達(dá)和沉默實(shí)驗(yàn)，然后檢測HL-7702細(xì)胞在細(xì)胞周期進(jìn)程以及細(xì)胞增殖能力方面的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)RAD6能夠促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，而RAD6的沉默所產(chǎn)生影響則截然相反。因?yàn)樵缬性S多文獻(xiàn)報(bào)

4、道細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)是決定細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子，由此可以推測RAD6對(duì)細(xì)胞的影響可能是通過調(diào)控CCND1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。對(duì)CCND1表達(dá)水平的分析以及RNA干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)RAD6確實(shí)是通過調(diào)控CCND1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程以及細(xì)胞增殖能力的影響。為了進(jìn)一步了解RAD6調(diào)控CCND1表達(dá)的分子機(jī)制，本研究通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來分析RAD6對(duì)CCND1啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)RAD6

5、能夠提高CCND1基因啟動(dòng)子區(qū)域中組蛋白H2B的單泛素化的水平和H3K4三甲基化的水平，從而促進(jìn)CCND1的轉(zhuǎn)錄。在了解了RAD6與CCND1的相互作用對(duì)于細(xì)胞周期進(jìn)程以及細(xì)胞增殖的影響后，本研究又通過生物信息學(xué)的方法來分析其在臨床上的應(yīng)用價(jià)值。Kaplan-Meier生存率分析和基因表達(dá)水平的分析均表明，在乳腺癌病人的臨床樣品中RAD6與CCND1之間存在明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系，能在一定程度上反映出癌癥的發(fā)生與發(fā)展，為病人的治療提供了理論基礎(chǔ)