豬睪丸細(xì)胞多次傳代的CSFV E2基因遺傳變異及E2蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的研究.pdf

1、豬瘟病毒(CSFV)E2基因是目前研制豬瘟基因工程疫苗的首選基因，其所編碼的gp55蛋白是CSFV的主要保護(hù)性抗原。采用豬睪丸細(xì)胞(ST)做為受體細(xì)胞，結(jié)合使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體來(lái)表達(dá)E2基因，首先可充分利用受體細(xì)胞遺傳密碼子的嗜好性提高重組蛋白的表達(dá)量，另外因ST來(lái)源于豬，其后加工與其他表達(dá)宿主相比具有優(yōu)越性，其疫苗的免疫保護(hù)力和免疫原性有望得到進(jìn)一步提高，為CSFV基因工程疫苗推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究包括三個(gè)試驗(yàn)內(nèi)

2、容，首先對(duì)CSFV福建地方流行株FJ1和FJ2株的E2基因進(jìn)行了克隆與測(cè)序，分析與豬瘟(CSF)疫苗C株的同源性，初步了解福建地方分離株的變異情況。其次利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)方法，對(duì)多次ST傳代的和多次動(dòng)物傳代的CSF石門(mén)強(qiáng)毒株(Shimen株)E2基因的序列分別進(jìn)行了測(cè)定，并與標(biāo)準(zhǔn)Shimen株E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性進(jìn)行比較，旨在探討CSFV在ST中多次傳代后的遺傳穩(wěn)定性。最后利用ST作

3、為受體細(xì)胞來(lái)表達(dá)CSFV的E2基因，為建立用重組蛋白作為抗原的CSFV檢測(cè)方法和CSF基因工程疫苗的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究試驗(yàn)與結(jié)果如下：
　　 1.使用：PCR技術(shù)分別擴(kuò)增2株CSF福建地方流行毒株的E2基因，并克隆于pMD-18T載體進(jìn)行核苷酸測(cè)序，根據(jù)CSFV的Alfort株、Brescia株及C-株(疫苗毒)確定起始氨基酸三聯(lián)體位置后進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)，同時(shí)進(jìn)行同源性比較和E2蛋白結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)J1和FJ2株的E2

4、基因的長(zhǎng)度均為1170 bp，編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度均為384個(gè)氨基酸，包括完整的信號(hào)肽和部分跨膜序列。2毒株的E2基因核苷酸序列同源性為90.79％，氨基酸序列同源性為89.84％，其與C-株E2基因的核苷酸序列同源性為82.87％-82.96％，氨基酸序列同源性為87.76％-90.10％，結(jié)果表明，2008年福建部分地區(qū)CSF流行毒與C-株的E2蛋白之間存有一定差異，這為當(dāng)前CSF防控奠定一定理論與物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 2.CS

5、FV Shimen株經(jīng)豬體多次傳代和ST多次傳代后，得到傳代病毒P-Shimen和ST-Shimen。利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增P-Shimen和ST-Shimen株E2基因，并進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，比較分析P-Shimen株、ST-Shimen株及Shimen標(biāo)準(zhǔn)株的E2基因核苷酸和氨基酸序列同源性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P-Shimen株和Shimen標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列同源性為99.4％，氨基酸序列同源性為99.0％，ST-Shimen株和Shimen

6、標(biāo)準(zhǔn)株的核苷酸序列同源性為98.3％，氨基酸同源性為96.7％，結(jié)果顯示，ST-Shimen株E2基因較P-Shimen株的變異差異不明顯，并與Shimen標(biāo)準(zhǔn)株保持較高的同源性，結(jié)果表明了CSFV在ST中能保持其遺傳的相對(duì)穩(wěn)定性，為ST作為CSF疫苗制備的工具細(xì)胞提供可能。
　　 3.克隆CSFV的E2基因至pEGFP-C1真核表達(dá)載體上，使用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入ST中，通過(guò)熒光觀察和G418篩選出陽(yáng)性細(xì)胞克隆。熒光觀察和