HPV18 E2蛋白與hDaxx在細(xì)胞內(nèi)的共定位及對(duì)凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　分析人乳頭瘤病毒18型（HPV18）E2蛋白與hDaxx在細(xì)胞內(nèi)的分布與共定位，并初步研究?jī)煞N蛋白質(zhì)對(duì)凋亡的影響，為進(jìn)一步探索E2蛋白在HPV18致癌機(jī)制中的作用以及E2防治性疫苗的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　（1）將質(zhì)粒pEGFP-C1/E2和pDsRed-Monomer-C1分別用EcoRI與BamHⅠ雙酶切，前者回收小片段約1000bp酶切產(chǎn)物，后者回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E.co

2、li JM109，篩選陽(yáng)性克隆，構(gòu)建 Red-HPV18 E2融合蛋白表達(dá)載體pDsRed-Monomer-C1/E2。
　?。?）將質(zhì)粒pDsRed-Monomer-C1/E2轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞，利用倒置熒光顯微鏡觀察 HPV18 E2蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)與定位，并通過(guò)Western-blot進(jìn)一步檢測(cè)其表達(dá)。
　?。?）將質(zhì)粒pDsRed-Monomer-C1/E2與pEGFP-C1/hDaxx共同轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，利

3、用激光共聚焦顯微鏡觀察HPV18 E2蛋白與hDaxx的分布，并分析它們的共定位。
　　（4）將0.5μg與1.0μg pcDNA3.1(-)/hDaxx質(zhì)粒分別和2.0μg pcDNA3.1(-)/E2質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，設(shè)pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組和空細(xì)胞組作為對(duì)照。48h后，分別收集各組細(xì)胞，經(jīng)75％乙醇4℃固定過(guò)夜，PI染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。
　　（5）將0.5μg與1.0μg pcDNA

4、3.1(-)/hDaxx質(zhì)粒分別和2.0μg pcDNA3.1(-)/E2質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，設(shè)pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組和空細(xì)胞組作為對(duì)照，培養(yǎng)48h后，分別收集各組細(xì)胞，按Caspase-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm波長(zhǎng)下的吸光度(A值)，計(jì)算Caspase-8的相對(duì)活性。
　　結(jié)果：
　?。?）重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，得到目的小片段約1100bp，測(cè)序分析所克隆的目的片段與 GenBank上公布的

5、HPV18 E2（NC_001562）基因序列一致，即構(gòu)建了pDsRed-Monomer-C1/E2重組體。
　?。?）真核表達(dá)載體pDsRed-Monomer-C1/E2能在HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)DsRed-HPV18 E2融合蛋白，且主要分布于細(xì)胞漿與細(xì)胞核。
　?。?）質(zhì)粒pEGFP-C1/hDaxx轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，hDaxx定位細(xì)胞核；質(zhì)粒pEGFP-C1/hDaxx和pDsRed-Monomer-C1/E2共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，hD

6、axx在細(xì)胞漿與細(xì)胞核均有，且綠色與紅色熒光重疊為黃色熒光，即HPV18 E2蛋白與hDaxx發(fā)生共定位。
　?。?）2μg pcDNA3.1(-)/E2+1.0μg pcDNA3.1(-)/hDaxx組凋亡率明顯高于2μg pcDNA3.1(-)/E2+0.5μg pcDNA3.1(-)/hDaxx組，差異具有顯著性（P＜0.001）；且兩組凋亡率都顯著高于其他組，差異具有顯著性（P＜0.001）。pcDNA3.1(-)/E2組

7、凋亡率明顯高于pcDNA3.1(-)組及空細(xì)胞組，差異具有顯著性（P＜0.001）。
　?。?）2μg pcDNA3.1(-)/E2+1.0μg pcDNA3.1(-)/hDaxx組Caspase-8的相對(duì)活性高于2μg pcDNA3.1(-)/E2+0.5μg pcDNA3.1(-)/hDaxx組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且兩組凋亡率都顯著高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。pcDNA3.1(-)/E2組Ca

8、spase-8的相對(duì)活性高于pcDNA3.1(-)/ hDaxx、pcDNA3.1(-)組及空細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　?。?）構(gòu)建的pDsRed-Monomer-C1/E2真核表達(dá)載體能在HeLa細(xì)胞表達(dá)DsRed-HPV18 E2融合蛋白。
　?。?）HPV18 E2蛋白與hDaxx共定位細(xì)胞漿與細(xì)胞核，且E2蛋白使部分hDaxx從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞漿。
　?。?）HPV18 E