HPV18型E7抗原B細胞表位的預測與鑒定.pdf

1、目的：人乳頭瘤病毒（HPV）是一類感染表皮和粘膜鱗狀上皮的DNA病毒，其中，高危型HPV18與尖銳濕疣、宮頸上皮內瘤以及其他上皮性腫瘤的發(fā)生相關。HPV18早期蛋白E7是特異性的腫瘤抗原，作為一種理想的靶抗原在免疫治療研究中倍受重視。本研究中，通過計算機輔助算法來篩選HPV18E7抗原的B細胞表位，并通過對其進行免疫學評價進一步鑒定預測的B細胞表位能否誘導抗原肽特異性抗體產(chǎn)生。為制備針對HPV18感染的治療性疫苗提供候選表位。

2、方法：①計算機軟件預測。采用親水性方案、柔韌性方案、抗原指數(shù)方案及表面可能性方案對HPV18型E7抗原B細胞表位進行綜合評估，確定候選的B細胞表位。②預測肽合成、純化及質譜鑒定。采用標準的Fmoc方案合成多肽，合成的多肽經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析，并用質譜進行定性鑒定。③表位多肽的免疫效果評價。實驗組分別以P1、P2、P3三條合成肽免疫Balb/c小鼠，陰性組以生理鹽水作為對照，與弗氏完全佐劑混合乳化后于0、2、4周在腋下、腹股溝及

3、腹腔多點注射，于初次免疫后的1、3、5周，分別采集并制備各實驗組及陰性對照組小鼠血清。④收集人乳頭瘤病毒18型。收集新鮮宮頸癌標本1例（PCR法檢測HPV18陽性），將標本碾碎、超聲破膜，離心收集HPV病毒。⑤間接ELISA法進行鑒定。分別以合成肽段和宮頸癌組織上清液包被酶聯(lián)板，與采集的各實驗組小鼠血清結合，以陰性組小鼠血清作為對照。酶標二抗為羊抗小鼠IgG，底物為TMB[四甲基聯(lián)苯胺]。用酶標儀于492nm波長處測定吸光度A值。

4、 結果：①綜合各方案分析考慮：人乳頭瘤病毒18E7蛋白的第15-22位，29-44位，51-59位，即E715-22（LEPQNEIP），E729-44（EQLSDSEEENDEIDGV），E751-59（ARRAEPQRH）可能是B細胞優(yōu)勢表位。分別命名為P1、P2和P3。②多肽經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析，合成肽的純度大于90%，經(jīng)質譜分析合成肽的分子量測定值與理論值相符。⑨以三條多肽鏈包被酶聯(lián)板，與免疫后小鼠血清抗體結合反應。

5、初次免疫后第1周，實驗組小鼠血清抗體滴度均呈陰性；第3周，表位多肽P2、P3組均出現(xiàn)陽性，與陰性對照組具有顯著性差異，P1組為陰性；第5周，P1、P2、P3組均出現(xiàn)陽性結果，與陰性對照組均有顯著性差異。④以宮頸癌組織上清液包被酶聯(lián)板，只有P2、P3組產(chǎn)生的小鼠血清抗體與其結合反應呈陽性，表位肽P1產(chǎn)生的抗體不呈現(xiàn)陽性反應。 結論：①多種預測方案聯(lián)合應用可提高預測效率，避免了在研究人乳頭瘤病毒18E7抗原表位時盲目合成多肽。②人乳