HCV E2蛋白促進B淋巴細胞活化和增殖的機制及E2蛋白突變體免疫原性分析.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是帶有包膜的正鏈RNA病毒，主要經(jīng)血液傳播，引起急、慢性丙型肝炎，并可導(dǎo)致肝硬化和肝細胞癌。HCV感染除引起肝臟病變外，還可引起多種肝臟外組織損害，與B細胞淋巴瘤、冷球蛋白血癥等多種肝外疾病有關(guān)。目前全球HCV感染者約有1.7億，HCV感染的慢性率高達80％。HCV的基因變異，對宿主細胞內(nèi)免疫的拮抗作用以及相對低水平表達和復(fù)制等均與HCV慢性感染有關(guān)。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，HCV包

2、膜E2蛋白與CD81分子結(jié)合所致免疫細胞的功能紊亂也可能是HCV慢性感染的重要原因，并且與B細胞淋巴瘤以及冷球蛋白血癥具有重要相關(guān)性。HCV包膜E2蛋白的CD81結(jié)合活性還可能與HCV感染難以誘導(dǎo)中和抗體而導(dǎo)致慢性感染有關(guān)。 一、HCV包膜蛋白E2促進B淋巴細胞活化和增殖的作用機制 HCV包膜E2蛋白通過與B淋巴細胞表面上CD81分子的作用，改變了B細胞激活的正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致B淋巴細胞非特異性活化。我們構(gòu)建了HCV

3、包膜E2蛋白的表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細胞表達HCVE2蛋白。將表達的E2蛋白固定在事先包被了E2單抗的酶標微孔板上，然后加入Burkitt淋巴瘤Raji細胞，可觀察到該細胞聚集貼附生長。然而用siRNA下調(diào)Raiji細胞表面CD81的表達，則不能使Raji細胞聚集貼附生長，說明表達的E2蛋白能夠與Raji細胞表面的CD81分子結(jié)合。進一步我們制備固定化的E2蛋白，并分別用固定化的E2和可溶性E2蛋白刺激Raji細胞，然后分析細胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸

4、化的水平。結(jié)果表明，固相化的E2蛋白可有效上調(diào)Raji細胞內(nèi)的蛋白酪氨酸磷酸化的水平，而可溶性E2對Raji細胞內(nèi)的蛋白酪氨酸磷酸化水平則無明顯影響。這可能是因為固相化的E2蛋白類似天然的病毒顆粒，在構(gòu)象上要更接近于天然的病毒顆粒表面E2蛋白，而且固相化后的E2蛋白在單位體積的密度要高于可溶性的E2蛋白單位體積的密度，使其能夠更充分的與細胞表面的CD81分子相互接觸作用。 構(gòu)建CD81分子siRNA的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染293T細胞

5、包裝出病毒后感染Raji細胞，流式檢測：Raji細胞表面CD81分子表達被抑制，進一步用固相化的E2蛋白刺激該CD81表達下調(diào)的Raji細胞，則觀察到Raji細胞內(nèi)的蛋白酪氨酸磷酸化水平無明顯的變化，這說明E2蛋白對Raji細胞的信號調(diào)節(jié)是經(jīng)由CD81分子作用的。固相化的E2蛋白刺激Raji細胞后用western blotting技術(shù)檢測細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax蛋白的表達，可以觀察到Bcl-2蛋白表達下降，而Bax蛋白表達增

6、加。Bcl-2基因是人體最主要的抗凋亡基因，它編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物定位于線粒體內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜上，其主要生物學(xué)功能是延長細胞的壽命，增加細胞對各種凋亡刺激因素的抵抗力．它可導(dǎo)致DNA受損的細胞持續(xù)生存，突變產(chǎn)物聚集，從而促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)具有加速細胞凋亡的功能，Bax可與抗凋亡基因Bcl-2形成異源二聚體，具有抑制Bcl-2，促進細胞凋亡的作用。Bcl-2與Bax兩者之間的比例決定了細胞的命運，若Bax

7、占多數(shù)，則Bcl-2被抑制，凋亡被誘導(dǎo)，細胞死亡；反之則Bax受到抑制，細胞得以生存。E2蛋白刺激Raji細胞后促進Bcl-2的表達而抑制Bax的表達，這說明E2蛋白能夠增強Raji細胞的抗凋亡能力。E2蛋白能夠誘導(dǎo)B細胞蛋白酪氨發(fā)生酸磷酸化且促進B細胞的抗凋亡的能力，這些可能是E2促進B細胞增殖的重要機制。用流式細胞技術(shù)檢測固相化HCV E2蛋白刺激的Raji細胞表面CD80、CD86和CD21分子的表達，結(jié)果可看到CD80和CD86

8、分子的表達上調(diào)，而CD21分子的表達下降，CD80、CD86和CD21是與B淋巴細胞的活化緊密相關(guān)的膜表面分子，這說明E2蛋白能刺激Raji細胞的活化，從而也促進Raji細胞的增殖。 二、HCV E2蛋白突變體免疫原性分析 研究表明HCV包膜E2蛋白可誘導(dǎo)B淋巴細胞蛋白酪氨酸磷酸化，通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達而促進B淋巴瘤細胞的增殖，并且還能上調(diào)活化分子的表達，說明E2蛋白能通過激活胞

9、內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)。而E2對B細胞的激活可能導(dǎo)致HCV感染難以有效誘導(dǎo)中和抗體，因此，消除E2蛋白的CD81結(jié)合活性可能有利于中和抗體的誘導(dǎo)。 我們分別將H77株的E2蛋白的第442位苯丙氨酸(F)和529位的色氨酸(W)突變?yōu)楸彼?A)，構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，用E2多抗對細胞培養(yǎng)上清以及細胞裂解液中的E2蛋白表達進行檢測，結(jié)果表明突變對E2的表達和分泌無明顯影響。用ELISA分析兩種突變的E2蛋白與大腸桿菌表達的

10、Trx(硫氧還蛋白)-CD81 LEL(大胞外環(huán))融合蛋白的結(jié)合情況，結(jié)果顯示，該兩個位點的突變體不再具有與CD81大胞外環(huán)(LEL)的結(jié)合活性；進一步用流式細胞術(shù)(FACS)分析兩種E2突變體與表達CD81分子的CHO細胞結(jié)合情況表明，該兩個位點突變的E2蛋白不再具有與膜表面的CD81分子結(jié)合的功能。用突變體質(zhì)粒E2-W529/A和E2-W442/A轉(zhuǎn)染細胞后，免疫熒光檢測兩株構(gòu)象依賴性單抗與突變體E2蛋白的反應(yīng)，結(jié)果表明，該兩個位點

11、的突變對E2蛋白空間構(gòu)象無明顯影響。將固相化的兩種突變體E2蛋白分別刺激Raji細胞，沒有檢測到細胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化水平發(fā)生明顯變化，這表明，消除CD81結(jié)合活性可消除E2蛋白對Raji細胞胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活作用。 HCV E2蛋白第442和529位氨基酸分別位于兩個線性B細胞表位中，其中，前者所在表位抗體具有中和活性，而后者病毒中和活性并不明顯。因此，選擇529位的突變體進行免疫可有利于保留更多的中和抗體表位。我們將野生E

12、2與突變體E2-W529/A表達質(zhì)粒分別免疫小鼠，眼眶取血收集免疫小鼠的血清，分別用野生和突變的E2蛋白為靶抗原檢測小鼠的抗體動力學(xué)，結(jié)果表明，兩種DNA免疫小鼠血清的E2抗體動力學(xué)水平相似，這說明W529/A突變對于E2蛋白的免疫原性無明顯影響。524～531位氨基酸殘基APTYSWGA為一線性B細胞表位，其抗體能抑制E2蛋白與CD81的結(jié)合。我們將該表位與紅色熒光蛋白融合，構(gòu)建表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，用免疫熒光分析該表位與小鼠血清的結(jié)合，

13、結(jié)果表明，W529A的突變部分降低了該表位的免疫原性/抗原性。AP33表位為HCV E2蛋白第412～423位氨基酸殘基QLINTNGSWHIN，也為一線性B細胞表位，其在HCV的六個基因型中高度保守，AP33能有效中和HCV的感染性。同樣構(gòu)建該表位與紅色熒光蛋白RFP融合表達的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細胞用免疫熒光分析其與小鼠血清的結(jié)合表明，W529/A突變不影響該表位的抗體應(yīng)答，野生或突變E2均可誘導(dǎo)針對該表位的抗體。構(gòu)建11株HCV(涵蓋6個基

14、因型)包膜E2蛋白的表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細胞用免疫熒光分析小鼠免疫血清與這些不同株不同基因型E2蛋白的反應(yīng)，結(jié)果表明，E2-W529/A免疫血清可與該11株HCV包膜蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。為了評價免疫血清的中和作用，我們構(gòu)建了五株HCV包膜蛋白的HCVpp進行中和試驗。從結(jié)果可見，野生型E2以及E2-W529/A突變體免疫血清均可有效中和這八株HCVpp對靶細胞Huh7.5的感染性，且對同株HCVpp的中和效率無明顯差異。進一步我們用JHF-1株

15、HCVcc評價小鼠血清的中和作用，結(jié)果表明兩種質(zhì)粒免疫血清均可抑制HCVcc的感染性，抑制效率相似。 三、小結(jié) 1．本研究中用固相化的HCV包膜蛋白E2刺激人B淋巴細胞Raji細胞，可誘導(dǎo)Raji細胞內(nèi)的蛋白酪氨酸的磷酸化，而用siRNA．干擾掉B細胞表面CD81的表達后用E2蛋白再刺激Raji細胞，細胞內(nèi)酪氨酸磷酸化的水平未發(fā)生明顯的變化。而且E2蛋白刺激Raji細胞可上調(diào)Raji細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2蛋白的表達

16、，下調(diào)Bax蛋白的表達，并促進膜表面CD80、CD86分子的表達，下調(diào)膜表面CD21分子的表達。這些結(jié)果表明HCV包膜蛋白E2可通過與CD81分子作用改變B淋巴細胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而引起的B細胞的增殖和非特異性激活。 2．在此基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了一種E2蛋白突變體，將第529位色氨酸突變?yōu)楸彼?，該W529/A突變體不影響E2蛋白的空間構(gòu)象，但是消除了與CD81的結(jié)合活性。該突變體刺激B淋巴細胞后，對B細胞的胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化水