HCV E2蛋白經(jīng)DC-SIGN受體對(duì)Raf-MEK1-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控.pdf

1、病毒受體是位于細(xì)胞表面、由宿主細(xì)胞基因所編碼、參與病毒感染宿主細(xì)胞的分子或分子復(fù)合物，決定病毒的宿主細(xì)胞特異性、組織嗜性及致病性的主要因素之一。病毒可以與一個(gè)或一個(gè)以上的細(xì)胞表面受體結(jié)合，在不同類型細(xì)胞可共用相同受體，而同種病毒在不同類型細(xì)胞所結(jié)合的受體也有可能不同。 目前，對(duì)于丙型肝炎病毒(HCV)進(jìn)入宿主細(xì)胞的確切機(jī)制仍不十分清楚，但一般認(rèn)為病毒表面包膜蛋白與其特異性受體的結(jié)合是病毒感染細(xì)胞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究人員應(yīng)用真核細(xì)胞表

2、達(dá)的HCV主要包膜蛋白E2、E1/E2異二聚體、類病毒顆粒為工具，在體外模擬天然病毒體與靶細(xì)胞的相互作用。相繼發(fā)現(xiàn)了人細(xì)胞表面CD81、低密度脂蛋白受體(LDLR)、B型清道夫受體Ⅰ(SRBI)、樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞粘附分子-3-結(jié)合非整合素分子(DC-SIGN)和肝/淋巴細(xì)胞特異性細(xì)胞間粘附分子-3-結(jié)合整合素分子(L-SIGN)等，認(rèn)為上述分子可作為HCV受體而介導(dǎo)HCV與靶細(xì)胞的結(jié)合。近期的研究表明，HCV和HCVE2蛋白可以與樹(shù)

3、突狀細(xì)胞表面的DC-SIGN或肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面的L-SIGN結(jié)合，該復(fù)合物進(jìn)入早期內(nèi)質(zhì)體以逃避溶酶體對(duì)HCV的降解，從而利于其在體內(nèi)播散，并在體內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間保持感染性，高度提示此與HCV的慢性感染有關(guān)。但這些受體如何參與對(duì)HCV或HCVE2蛋白的識(shí)別、介導(dǎo)結(jié)合以及傳遞其刺激至靶細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑還不完全清楚。 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與對(duì)多種細(xì)胞功能的調(diào)控。生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激信號(hào)及有絲分裂原等細(xì)胞外信號(hào)等可通

4、過(guò)多種途徑激活MAPK家族成員、介導(dǎo)各類細(xì)胞反應(yīng)，其中Raf-MEK1/2通路主要介導(dǎo)來(lái)自生長(zhǎng)因子和有絲分裂原等細(xì)胞外信號(hào)的信號(hào)傳遞，與細(xì)胞增殖有關(guān)。研究揭示，許多病毒可通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而發(fā)揮致病作用。雖然HCV結(jié)構(gòu)及非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控被認(rèn)為與其致病機(jī)制密切相關(guān)，但HCV包膜蛋白在HCV的致病過(guò)程中所起的作用仍需做進(jìn)一步探討。 因HCV與靶細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合為其致病過(guò)程的首發(fā)事件，故此可能在HCV

5、致病機(jī)制中占極重要的地位。本教研室前期工作，研究CHO細(xì)胞表達(dá)HCVE2蛋白經(jīng)人CD81和LDLR受體所引發(fā)靶細(xì)胞的異?？缒ば盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與HCV致病性的關(guān)聯(lián)。在上述研究的基礎(chǔ)上，本課題側(cè)重研究DC-SIGN在識(shí)別、接受并傳遞HCVE2信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)Raf-MEK1/2途徑中的作用。以HCVE2蛋白、DC-SIGN受體、Raf-MEK1/2途徑為研究體系，選擇穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN的細(xì)胞及瞬時(shí)表達(dá)DC-SIGN的細(xì)胞為研究對(duì)象，擬闡明HCVE2

6、蛋白與DC-SIGN的作用特性，探討HCVE2蛋白經(jīng)DC-SIGN受體對(duì)Raf-MEK1/2途徑的調(diào)控。 一、HCVE2蛋白經(jīng)DC-SIGN對(duì)細(xì)胞Raf-MEK1/2途徑的調(diào)控以MLV為載體構(gòu)建DC-SIGN、L-SIGN的表達(dá)質(zhì)粒MX-DC-SIGN、MX-L-SIGN，并用其轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN和L-SIGN的NIH3T3/MX-DC-SIGN和NIH3T3/MX-L-SIGN細(xì)胞株。流式細(xì)胞術(shù)

7、檢測(cè)表明，NIH3T3/MX-DC-SIGN和NIH3T3/MX-L-SIGN細(xì)胞高表達(dá)DC-SIGN(陽(yáng)性細(xì)胞為99.58％)和L-SIGN(陽(yáng)性細(xì)胞為92.39％)，并且均可與HCVE2蛋白以較高比例結(jié)合(陽(yáng)性細(xì)胞分別為73.27％和77.79％)。與之相反，親本NIH3T3細(xì)胞不表達(dá)DC-SIGN和L-SIGN，也不與HCVE2蛋白結(jié)合。競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DC-SIGN單抗和L-SIGN單抗可抑制HCVE2蛋白與NIH3T3/MX

8、-DC-SIGN和NIH3T3/MX-L-SIGN細(xì)胞的結(jié)合，該抑制作用與單抗?jié)舛瘸蕜┝恳蕾囮P(guān)系。 進(jìn)一步采用激光共聚焦的方法，研究細(xì)胞表面DC-SIGN的表達(dá)和HCVE2蛋白的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，NIH3T3/MX-DC-SIGN細(xì)胞表面有DC-SIGN的表達(dá)(綠色熒光)和HCVE2蛋白的結(jié)合(紅色熒光)，黃色熒光則提示DC-SIGN與HCVE2蛋白于細(xì)胞膜表面的共定位。同時(shí)，親本NIH3T3細(xì)胞表面無(wú)DC-SIGN的表達(dá)和H

9、CVE2蛋白的結(jié)合。 Raf-MEK1/2途徑中，c-Raf的活化表現(xiàn)為第338位絲氨酸(Ser338)的磷酸化，MEK1/2的活化則表現(xiàn)為第217位和221位絲氨酸(Ser217/221)的磷酸化，磷酸化反應(yīng)的強(qiáng)弱反映了激酶的激活程度。為確定HCVE2蛋白刺激Raf、MEK1/2的適宜條件，E2蛋白以不同時(shí)間刺激NIH3T3/MX-DC-SIGN細(xì)胞，收集各時(shí)間段的細(xì)胞進(jìn)行裂解，于細(xì)胞裂解液中檢測(cè)激酶。免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2μg

10、/mlHCVE2蛋白刺激30min可有效激活細(xì)胞內(nèi)Raf和MEK1/2，表現(xiàn)為這兩種激酶的磷酸化水平升高，并且各份樣品中非磷酸化的Raf、MEK1/2總量基本一致，從而保證了實(shí)驗(yàn)體系的可比性。進(jìn)一步研究DC-SIGN在HCVE2蛋白上調(diào)Raf、MEK1/2磷酸化過(guò)程中的作用，發(fā)現(xiàn)DC-SIGN單抗、L-SIGN單抗均可減弱HCVE2蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)Raf、MEK1/2的激活程度。此外，MEK1/2激酶抑制劑-U0126的預(yù)處理也明顯抑制E2

11、蛋白對(duì)MEK1/2的激活。與之相反，HCVE2蛋白刺激對(duì)NIH3T3細(xì)胞內(nèi)Raf、MEK1/2磷酸化反應(yīng)無(wú)明顯影響，并且DC-SIGN單抗、L-SIGN單抗亦無(wú)抑制作用。 上述結(jié)果表明，CHO細(xì)胞表達(dá)的HCVE2蛋白與DC-SIGN相互作用；E2蛋白上調(diào)Raf、MEK1/2激酶的磷酸化水平，該磷酸化反應(yīng)的強(qiáng)度同E2刺激持續(xù)時(shí)間有關(guān)；E2蛋白可經(jīng)DC-SIGN受體而激活Raf、MEK1/2激酶。 二、DC-SIGN/L-S

12、IGN熒光表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在真核細(xì)胞中的表達(dá)PCR擴(kuò)增DC-SIGN和L-SIGN基因片段，分別亞克隆到pMD18-T載體，BamHⅠ/HindⅢ酶切并回收DC-SIGN和L-SIGN基因片段以及pEGFP-N1綠色熒光表達(dá)載體，將DC-SIGN和L-SIGN/BamHⅠ+HindⅢ基因片段分別與pEGFP-N1/BamHⅠ+HindⅢ連接，構(gòu)建含DC-SIGN或L-SIGN的熒光表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-DC-SIGN和pEGFP-

13、N1-L-SIGN。將pEGFP-N1-DC-SIGN和pEGFP-N1-L-SIGN分別轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞(HEK293T)和人宮頸癌HeLa細(xì)胞，并于6、12、24、48小時(shí)動(dòng)態(tài)觀察熒光變化情況。熒光顯微鏡觀察顯示，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，兩種細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)綠色熒光，并且HEK293T細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于HeLa細(xì)胞。同時(shí)，經(jīng)免疫印跡分析，pEGFP-N1-DC-SIGN轉(zhuǎn)染的HEK293T和HeLa細(xì)胞中均可檢測(cè)到DC-SIGN的表達(dá)