調(diào)控局部ACE2和Mas受體對(duì)LPS致急性肺損傷的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究.pdf

1、急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)是一種以急性呼吸衰竭及嚴(yán)重低氧血癥為特征的危重疾病。盡管臨床醫(yī)療措施不斷進(jìn)步，但是這一危重疾病的死亡率仍＞30％，是重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)威脅患者生命的主要原因之一。急性呼吸窘迫綜合征可由各種肺內(nèi)、肺外致病因素導(dǎo)致，其中膿毒癥是最常見(jiàn)的病因。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，由革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁釋放而出，被認(rèn)為是導(dǎo)致嚴(yán)重膿

2、毒癥的始發(fā)因素。
　　近年來(lái)的研究顯示，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)包含兩個(gè)功能互相拮抗的軸系:血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)-血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)-血管緊張素Ⅱ的1型受體(AT-1R)和血管緊張素2(ACE2)-血管緊張素1-7(Ang1-7)-Mas受體。其中，ACE和ACE2協(xié)同調(diào)節(jié)AngⅡ及Ang1-7的水平，可能在ARDS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用;然而，其在局部肺組織的調(diào)

3、節(jié)和具體的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚未闡明。
　　絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號(hào)通路是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分，在急性肺損傷(acute lung injury, ALI)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　因此，我們提出假設(shè):在LPS導(dǎo)致急性肺損傷過(guò)程中，局部RAS成分發(fā)生改變，調(diào)控局部ACE/ACE2的表達(dá)可改善肺損傷，而MAPKs信號(hào)通路在其中發(fā)揮關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作

4、用。
　　本研究共分以下三部分內(nèi)容:
　　第一部分血管緊張素抑制劑(ACEI)預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷的作用及其機(jī)制
　　目的:觀察ACEI預(yù)處理在LPS導(dǎo)致急性肺損傷時(shí)的作用并探討其作用機(jī)制。
　　方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)-經(jīng)尾靜脈注射LPS(7.5mg/Kg)建立大鼠急性肺損傷模型;干預(yù)組大鼠在注射LPS前30分鐘經(jīng)腹腔給予卡托普利(Captopril，50mg/Kg)預(yù)處理，對(duì)照組給予等量生理鹽水。體外實(shí)驗(yàn)-

5、大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)卡托普利（10-5mol/ml），或合并應(yīng)用ACE2抑制劑MLN-4760(10-7mol/ml)預(yù)處理30分鐘后給予LPS(1mg/ml)刺激。肺組織切片HE染色評(píng)估肺損傷程度，免疫組化染色及western-blot檢測(cè)肺組織ACE/ACE2表達(dá)，ELISA法檢測(cè)血漿及細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、AngⅡ及Ang1-7濃度，western-blot法檢測(cè)細(xì)胞中ACE/ACE2表達(dá)及MAPKs信號(hào)通路

6、激活。
　　結(jié)果:卡托普利預(yù)處理可明顯減輕LPS導(dǎo)致的肺組織病理改變，抑制炎癥因子TNF-α及IL-6分泌，降低血漿AngⅡ/Ang1-7比例，并逆轉(zhuǎn)肺組織中ACE上調(diào)和ACE2下調(diào)的表達(dá)變化，顯著降低ACE/ACE2比值（LPS組為7.07，LPS+Captopril組為1.71）?？ㄍ衅绽谋Ｗo(hù)作用在體外實(shí)驗(yàn)中亦得到證實(shí)。卡托普利預(yù)處理明顯減輕LPS所致細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生，也顯著降低ACE/ACE2表達(dá)比值(LPS組為

7、5.18，LPS+Captopril組為1.52)。另外，卡托普利預(yù)處理可明顯抑制LPS刺激所致細(xì)胞p38MAPK、ERK1/2及JNK磷酸化水平升高。同時(shí)應(yīng)用MLN-4760預(yù)處理可阻斷卡托普利對(duì)LPS所致細(xì)胞毒性的保護(hù)作用及對(duì)LPS導(dǎo)致p38MAPK、ERK1/2及JNK磷酸化的抑制作用。
　　結(jié)論:ACEI預(yù)處理可能通過(guò)調(diào)節(jié)局部ACE/ACE2表達(dá)平衡及抑制MAPKs信號(hào)通路活化，發(fā)揮對(duì)LPS所致急性肺損傷及PMVECs細(xì)胞

8、毒性的保護(hù)作用。
　　第二部分慢病毒轉(zhuǎn)染Ace2或shRNA-Ace2調(diào)控大鼠PMVECs的ACE2表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制
　　目的:通過(guò)調(diào)控ACE2在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，探討其對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用及信號(hào)機(jī)制。
　　方法:應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染Ace2或shRNA-Ace2，使ACE2在PMVECs過(guò)表達(dá)或抑制，結(jié)合應(yīng)用Mas受體阻滯劑A779(100 nM)、MAPKs通路阻滯

9、劑(SB20358010μM，PD9805920μM，SP60012520μM)預(yù)處理后，給予LPS(1mg/ml)刺激。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、AngⅡ及Ang1-7濃度，western-blot法檢測(cè)細(xì)胞中ACE/ACE2表達(dá)及MAPKs/NF-κB信號(hào)通路激活。
　　結(jié)果:LPS刺激導(dǎo)致PMVECs分泌炎癥因子及AngⅡ及Ang1-7明顯增加，細(xì)胞凋亡顯著，并伴有

10、ACE2/ACE比值明顯下降;過(guò)表達(dá)ACE2可明顯減少LPS導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放，并使ACE2/ACE比值及Ang1-7水平顯著升高;而抑制ACE2表達(dá)則進(jìn)一步加重細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng);應(yīng)用A779預(yù)處理可完全消除ACE2對(duì)細(xì)胞的這種保護(hù)作用。LPS刺激可使細(xì)胞內(nèi)p38、ERK1/2、JNK及NF-κB信號(hào)通路激活，A799預(yù)處理進(jìn)一步提高其磷酸化水平。A779預(yù)處理亦可阻斷過(guò)表達(dá)ACE2對(duì)p38、JNK磷酸化及NF-κB激活的抑

11、制。然而，僅有JNK阻斷劑可明顯減輕由下調(diào)ACE2或A779預(yù)處理惡化的LPS所致細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)論:ACE2/Ang1-7/Mas受體軸在抑制LPS誘導(dǎo)PMVECs凋亡及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制可能是通過(guò)阻滯JNK/NF-κB信號(hào)通路激活。
　　第三部分慢病毒轉(zhuǎn)染Ace2或shRNA-Ace2調(diào)控大鼠肺內(nèi)ACE2表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的作用及其機(jī)制
　　目的:通過(guò)調(diào)控大鼠肺內(nèi)ACE2表達(dá)，觀察其

12、對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的作用及信號(hào)機(jī)制。
　　方法:經(jīng)氣管內(nèi)滴注慢病毒顆粒包裹的Ace2或shRNA-Ace2進(jìn)行大鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)ACE2的表達(dá)，或結(jié)合應(yīng)用MLN-4760(1mg/Kg)或A779(10μg/kg)預(yù)處理，繼之經(jīng)尾靜脈注射LPS(7.5mg/Kg)建立肺損傷模型。肺組織切片HE染色評(píng)估肺損傷程度，ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、AngⅡ及Ang1-7濃度，western-blot法檢測(cè)肺組織中

13、ACE/ACE2表達(dá)及MAPKs信號(hào)通路磷酸化水平，RT-PCR法檢測(cè)肺組織中Mas mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:ACE2過(guò)表達(dá)可以明顯減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷程度及炎癥因子釋放，抑制ACE2表達(dá)則顯著惡化肺損傷及炎癥反應(yīng)，而藥物阻斷Mas受體或ACE2均可抑制過(guò)表達(dá)ACE2的這一保護(hù)作用。過(guò)表達(dá)ACE2可明顯降低肺泡灌洗液中AngⅡ/Ang1-7比例，并上調(diào)Mas mRNA表達(dá)，而Mas受體阻斷劑或ACE2抑制劑均可顯著逆轉(zhuǎn)上述

14、變化。ACE2過(guò)表達(dá)可明顯抑制LPS導(dǎo)致p38、ERK1/2、及JNK激活，而抑制ACE2表達(dá)則明顯增強(qiáng)ERK1/2、JNK磷酸化水平。Mas受體阻斷劑或ACE2抑制劑均可明顯消除ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)p38、ERK1/2磷酸化的抑制。
　　結(jié)論:ACE2主要通過(guò)Ang1-7/Mas途徑及抑制p38、EKR1/2信號(hào)通路激活發(fā)揮對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的保護(hù)作用。
　　總結(jié):
　　在內(nèi)毒素導(dǎo)致急性肺損傷過(guò)程中，肺組織內(nèi)ACE2