CCK-8對LPS誘導(dǎo)大鼠TASMCs的調(diào)節(jié)作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制探討.pdf

1、內(nèi)毒素休克(endotoxic shock，ES)是臨床各科常見的危重病理過程，內(nèi)毒素休克及其合并癥多器官功能障礙綜合癥是ICU患者最常見的死亡原因。在內(nèi)毒素休克的發(fā)病早期，體循環(huán)血管舒張、平均動脈壓(meanarterial pressure，MAP)進(jìn)行性降低是其特征性病理變化。內(nèi)毒素的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子可引起血管調(diào)控超氧化物岐化酶(superoxide di

2、smutase，SOD)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)的異常表達(dá)，氧自由基、一氧化氮(nitric oxide,NO)等生成增多，干擾血管的調(diào)節(jié)機(jī)制，可能是ES早期血壓降低的重要原因。 鑒于VSMC是血管的功能細(xì)胞，本課題在我室系列研究的基礎(chǔ)上，以體外培養(yǎng)的大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞(thoracic aortic smooth musclecells，TASMCs)為

3、研究對象，擬觀察CCK-8對LPS誘導(dǎo)大鼠TASMCsiNOS和不同類型SOD表達(dá)的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以及CCK-8對LPS誘導(dǎo)大鼠TASMCs 阿片受體表達(dá)的影響及其在受體水平的交互作用，以進(jìn)一步探討CCK-8緩解ES大鼠血管功能障礙的分子機(jī)制。 1 CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)大鼠TASMCs iNOS表達(dá)的受體機(jī)制研究1.1 CCK受體在大鼠TASMCs中的表達(dá)及LPS的影響 目的：為了探討CCK受體在大鼠TASM

4、Cs中的表達(dá)及不同劑量及不同時(shí)間LPS對CCK受體表達(dá)的影響。 方法：用貼塊法培養(yǎng)大鼠TASMCs，給予LPS(0.1mg/L)孵育細(xì)胞不同時(shí)間，采用RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測CCK-AR和CCK-BR的基因和蛋白表達(dá)及LPS對其表達(dá)的影響。數(shù)據(jù)用x±S表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用ANOVA及LSD進(jìn)行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)論：在體外培養(yǎng)的大鼠TASMCs中存在著C

5、CK-AR和CCK-BRmRNA及蛋白的表達(dá)；LPS可誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)。 本部分將主要觀察CCK-8對LPS誘導(dǎo)TASMCs iNOS表達(dá)及CCK-AR拮抗劑CR-1409和CCK-BR拮抗劑CR-2945對其的影響，以闡明CCK-8的抗休克作用機(jī)制。 方法：培養(yǎng)大鼠TASMCs，在加入或不加入CCK-8和/或CCK受體拮抗劑CR-1409/CR-2945 的情況下，給予LPS刺激細(xì)胞16h，用RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞iN

6、OS mRNA的表達(dá)；Western blot技術(shù)檢測胞漿iNOS蛋白表達(dá)，以光密度值表示其相對含量。數(shù)據(jù)用x±S表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用ANOVA及LSD進(jìn)行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)論：LPS可增加TASMCs中iNOS mRNA及蛋白的表達(dá)；CCK-8抑制了LPS的這種作用； CCK-8的這種抑制作用是由其靶細(xì)胞膜上特異性受體介導(dǎo)的，且CCK-AR的作用略強(qiáng)于CCK-BR。

7、 2 CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠TASMCs SOD表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制初探 2.1 PTK通路參與CCK-8對LPS誘導(dǎo)的大鼠TASMCs NF-kB活性的影響 目的：NF-kB是內(nèi)毒素休克過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)作為NF-kB的上游蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞多種不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本部分主要研究CCK-8是否影響LPS誘導(dǎo)TASMCs中NF-kB活性變

8、化及PTK是否參與這一過程，以闡明CCK-8的抗休克信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法：培養(yǎng)大鼠TASMCs，在加入或不加入CCK-8和/或PTK特異性拮抗劑Genistein的情況下，用LPS刺激細(xì)胞一定時(shí)間，用電泳遷移率改變分析(EMSA)方法檢測細(xì)胞NF-kB活性變化；用Western blot技術(shù)分析細(xì)胞胞漿中IkB蛋白的表達(dá)水平；用免疫細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)觀測P65蛋白的核轉(zhuǎn)位。數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用

9、ANOVA及LSD進(jìn)行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)論：CCK-8可抑制LPS誘導(dǎo)的NF-kB活性增加，而PTK參與了這一過程，這可能是CCK-8抗內(nèi)毒素休克作用的上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一。 2.2 CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠TASMCs SOD表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 目的：超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)是機(jī)體清除自由基的重要抗氧化酶，可清除超氧陰離子；而內(nèi)毒

10、素休克的發(fā)病早期，體循環(huán)血管舒張、平均動脈壓進(jìn)行性降低與氧自由基的生成增多密切相關(guān)。我們的研究表明，CCK-8具有一定的抗內(nèi)毒素休克作用，可增強(qiáng)SOD的活性，翻轉(zhuǎn)LPS導(dǎo)致的SOD活性降低；抑制LPS誘導(dǎo)的Cu-ZnSOD及Mn SOD mRNA表達(dá)的增高。 本試驗(yàn)第二部分(1)已證實(shí)CCK-8可抑制LPS誘導(dǎo)的NF-kB活性增加，且PTK參與了這一過程。然而，CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠TASMCs SOD表達(dá)的的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)

11、制尚未闡明。鑒于NF-kB是參與LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自由基的重要轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步闡明CCK-8抗內(nèi)毒素休克效應(yīng)的分子機(jī)制，本部分內(nèi)容主要觀察Gen作用于CCK-8和LPS共同孵育的TASMCs后，Cu-Zn SOD及Mn SOD mRNA表達(dá)的變化。 方法：培養(yǎng)大鼠TASMCs，在加入或不加入CCK-8和/或Genistein的情況下，用LPS刺激細(xì)胞一定時(shí)間，用半定量RT-PCR檢測SODmRNA表達(dá)。數(shù)據(jù)用x±S表示，用SP

12、SS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用ANOVA及LSD進(jìn)行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)論：CCK-8可抑制LPS誘導(dǎo)的Cu-Zn SOD及Mn SOD mRNA表達(dá)的增高，且PTK介導(dǎo)了這一過程，這可能是CCK-8抗內(nèi)毒素休克作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一。 本部分內(nèi)容主要觀察PKC拮抗劑白屈菜赤堿(chelerythrine，CHE)、嗎啡作用于CCK-8和/或LPS孵育的 TASMCs后к阿片受體mRN

13、A表達(dá)變化，以闡明CCK-8調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)大鼠 TASMCs к阿片受體表達(dá)的分子機(jī)制。 方法：培養(yǎng)大鼠。TASMCs，在加入或不加入CCK-8和/或CHE、嗎啡的情況下，用LPS刺激細(xì)胞16h，用半定量RT-PCR檢測к阿片受體mRNA的表達(dá)。數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用ANOVA及LSD進(jìn)行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)論：CCK-8可通過PKC抑制LPS誘導(dǎo)大鼠

14、TASMCs к阿片受體mRNA表達(dá)的增高，這可能是CCK-8抗內(nèi)毒素休克作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一。 小結(jié) 本研究從受體、轉(zhuǎn)錄因子、與ES相關(guān)因子的基因及蛋白表達(dá)多個(gè)層次比較系統(tǒng)地研究了CCK-8對LPS誘導(dǎo) TASMCs的調(diào)節(jié)作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，取得以下新發(fā)現(xiàn)： 1．CCK-AR和CCKoBR在大鼠 TASMCs 中均有表達(dá)；LPS可明顯誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)，其中CCK-BR的相對表達(dá)量高于CCK-AR。 2

15、．CCK-8可劑量依賴性地抑制LPS引起大鼠TASMCs iNOS表達(dá)的增加，此作用是由其受體介導(dǎo)的。 3．CCK-8對LPS誘導(dǎo)大鼠TASMCs NF-кB的活化抑制作用，且PTK參與了此過程。 4．CCK-8可抑制LPS誘導(dǎo)大鼠TASMCs的Cu-ZnSOD、MnSOD mRNA表達(dá)，LPS-PTK-NF-kB-SOD通路可能是其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之一。 5．CCK-8可抑制LPS誘導(dǎo)大鼠 TASMCs 阿片受體基因表