AngⅡ?qū)ρ舆t整流鉀電流慢成分的調(diào)節(jié)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、心肌肥厚、心力衰竭（簡稱心衰）常常伴發(fā)室性心律失常，心衰病人約一半以上因惡性心律失常的發(fā)生而猝死（即心性猝死Suddencardiacdeath，SCD）。心肌肥厚、心衰時(shí)發(fā)生病理性電生理重構(gòu)，一個(gè)主要特征是動(dòng)作電位時(shí)程（actionpotentialduration，APD）的延長。不同的原因所致的多種心肌肥厚和心衰的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及人的心室肌細(xì)胞均觀察到K+電流的下調(diào)。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensinsyste

2、m，RAS）在心肌肥厚的病理過程中具有重要作用，血管緊張素Ⅱ是該系統(tǒng)發(fā)揮主要作用的體液因子。已知血管緊張素Ⅱ是造成心臟組織肥厚性重構(gòu)的重要原因，然而關(guān)于AngⅡ在心肌電重構(gòu)、心律失常產(chǎn)生中的作用了解很少。
　　 越來越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腎素.血管緊張素系統(tǒng)在房性和室性心律失常的病理過程中具有重要作用。在急性分離的大鼠和犬的心室細(xì)胞、及表達(dá)編碼Ito通道基因Kv4.3的哺乳細(xì)胞上，AngⅡ均可減小Ito電流密度。實(shí)驗(yàn)表明，選擇性心

3、肌組織過表達(dá)AngⅡ基因的小鼠在不增加循環(huán)AngⅡ水平的情況下出現(xiàn)明顯復(fù)極化延遲，伴高發(fā)的室性心律失常；與上述結(jié)果相似，Rivard等新近報(bào)道，心臟特異性過表達(dá)人類ATI受體基因小鼠的Ito、IKur（一種超快激活的延遲整流K+電流）及IK1均下調(diào)，造成復(fù)極延遲，動(dòng)作電位延長，伴自發(fā)室性心律失常。特別值得注意的是，年幼的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物即存在復(fù)極化延遲及高發(fā)的心律失常，而此時(shí)并不存在組織肥厚性重構(gòu)，表明電生理改變并非繼發(fā)于肥厚性重構(gòu)，而是刺激

4、ATI受體直接引起離子通道的改變。這些研究提示，AngⅡ直接對離子通道的調(diào)節(jié)作用可能是病理性電重構(gòu)的重要因素。
　　 延遲整流鉀電流IK是哺乳動(dòng)物和人的心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位主要的復(fù)極外向鉀電流，包括緩慢激活的延遲整流鉀電流（IKs）和快激活的延遲整流鉀電流（IKr）。目前認(rèn)為，IKs通道分子是由4個(gè)KCNQ1成孔道基因（α-亞單位）及2個(gè)輔助KCNE1（β-亞單位）組成。KCNQ1和KCNE1突變分別與I型（LQT1）和V型（LQ

5、T5）先天性QT間期延長綜合征有關(guān)。心肌肥厚、慢性心力衰竭和心肌梗塞等引起的電重構(gòu)，往往伴隨著IKs的減少，這就大大增加了致死性室性心律失常的發(fā)生。前期我們報(bào)道了，AngⅡ通過激動(dòng).AT1受體抑制豚鼠心室細(xì)胞IKr電流，此作用主要由細(xì)胞內(nèi)PKC信號(hào)通路中介。然而AngⅡ?qū)π氖壹Ks的調(diào)控作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在急性分離的豚鼠心室肌細(xì)胞及表達(dá)通道α、β-亞單位cDNA的人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）上，觀察了AngⅡ?qū)?/p>

6、心室肌IKs的直接調(diào)控作用，并分析了其作用的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制。
　　 第一部分AngⅡ抑制心室肌細(xì)胞的緩慢激活延遲整流鉀（IKs）電流目的：觀察AngⅡ?qū)﹄嗍笮氖壹〖?xì)胞IKs的影響。
　　 方法：在急性分離的豚鼠心室肌細(xì)胞，常規(guī)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄IKs電流，觀察AngⅡ?qū)Ks影響。
　　 結(jié)果：外液中加入AngⅡ（100nM）后，明顯減少了去極化外向電流及復(fù)極時(shí)的尾電流，當(dāng)去極電壓為+40mV時(shí)，尾電流由給藥前

7、的0.77±0.07pA/pF減小到0.49±o.07pA/pF。抑制作用2-3min出現(xiàn)，5-10min左右達(dá)到穩(wěn)態(tài)，電流的抑制作用沖洗后不能完全恢復(fù)。AngⅡ以濃度依賴方式抑制IKs，以IKs尾電流抑制率為縱座標(biāo)做出AngⅡ抑制IKs的量效曲線，經(jīng)Hill方程擬合后得到IC50=8.2923nM。AngⅡ?qū)﹄妷洪T控IKs通道半數(shù)激活電壓、激活及去激活時(shí)間常數(shù)都沒有影響。
　　 小結(jié)：AngⅡ抑制豚鼠心室肌的IKs電流，這種抑

8、制作用與通道的動(dòng)力學(xué)特征無關(guān)。
　　 第二部分AngⅡ通過PKCε亞型調(diào)節(jié)IKs電流目的：觀察AngⅡ?qū)﹄嗍笮氖壹〖?xì)胞IKs抑制作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 方法：在急性分離的豚鼠心室肌細(xì)胞上，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄IKs電流，觀察不同的PKC抑制劑或激活劑對AngⅡ抑制IKs作用的影響。
　　 結(jié)果：AT1受體阻斷劑Losartan（1μM）幾乎完全取消AngⅡ?qū)Ks電流的抑制作用，而AT2受體阻斷劑PD1

9、23319（1μM）則不影響AngⅡ的作用。PKC抑制劑Bis-1（100nM）和stausporine（100nM）明顯減弱AngⅡ?qū)Ks電流的抑制作用；PKC激動(dòng)劑PMA（100nM）也明顯減弱AngⅡ?qū)Ks電流的抑制作用；細(xì)胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA（20mM）并不影響AngⅡ?qū)Ks的抑制作用；選擇性PKC亞型抑制劑G06976（100nM，選擇性抑制Ca2+敏感PKC亞型）和Go6983（100nM，抑制傳統(tǒng)型、新型PK

10、C6和非典型PKCζ，而不影響新型PKCε）不影響AngⅡ?qū)Ks電流的抑制作用；PKCε亞型的轉(zhuǎn)位抑制劑εV1-2（100nM）明顯對抗了AngⅡ?qū)Ks電流的抑制作用。
　　 小結(jié)：AngⅡ通過激動(dòng)AT1受體、激活新型PKCε亞型而下調(diào)IKs通道功能。
　　 第三部分AngⅡ?qū)CNQ1/KCNE1通道的影響目的：分析AngⅡ?qū)Ξ愒幢磉_(dá)的KCNQ1/KCNE1通道電流影響及其分子機(jī)制。
　　 方法：采用脂質(zhì)體

11、介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，HEK293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染人KCNQ1、KCNE1及AT1受體cDNA，觀察AngⅡ?qū)νǖ离娏鞯挠绊憽?br>　　 結(jié)果：在轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞上，與豚鼠心室肌上觀察到的結(jié)果相似，AngⅡ激活A(yù)T1受體抑制KCNQ1/KCNE1電流，這種抑制作用可以被PKC抑制劑阻斷，并且AngⅡ不改變KCNQ1/KCNE1通道的電壓依賴性激活和通道的動(dòng)力學(xué)特征。AngⅡ?qū)为?dú)轉(zhuǎn)染α亞基的KCNQ1通道電流亦具有抑制作用，但抑制作用較

12、對KCNQ1/KCNE1通道的抑制作用減小，和對KCNQ1/KCNE1的抑制作用一樣，都未影響通道的電壓門控特征。鑒于KCNQ1/KCNE1/KCNE2三聚體通道動(dòng)力學(xué)特征最接近KCNQ1/KCNE1通道，我們觀察了AngⅡ?qū)CNQ1/KCNE1/KCNE2通道電流的影響，發(fā)現(xiàn)AngⅡ?qū)﹄娏鞯囊种谱饔妹黠@減弱。
　　 小結(jié)：1.AngⅡ通過AT1受體激活PKC途徑抑制KCNQ1/KCNE1電流。2.KCNQ1/KCNE1通道的

13、α和β亞基可能共同參與了AngⅡ?qū)νǖ赖恼{(diào)控作用。3KCNE2可能存在AngⅡ調(diào)控的PKC磷酸化位點(diǎn)，但激活此位點(diǎn)可能上調(diào)通道功能。
　　 1.AngⅡ作用于AT1受體，經(jīng)過PKC途經(jīng)抑制心室肌細(xì)胞的IKs和表達(dá)的KCNQ1/KCNE1電流，AngⅡ的抑制作用不影響通道的動(dòng)力學(xué)特征；
　　 2.PKCε是中介AngⅡ上述抑制作用的主要亞型；
　　 3.KCNQ1/KCNE1通道的α和β亞基可能共同參與了AngⅡ?qū)?/p>