SgLRPK1與SgCRK1基因的克隆及轉(zhuǎn)化柱花草研究.pdf

1、柱花草(Stylosanthes gμianensis)原產(chǎn)于中南美洲，是一種優(yōu)良的熱帶豆科牧草，主要用于放牧、水土保持、果園間作及干草粉加工，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、耐高溫及抗旱耐酸性等特點(diǎn)，但它易受冷害。植物體內(nèi)多種激素信號(hào)途徑相互關(guān)聯(lián)，而類(lèi)受體蛋白激酶（receptor-like protein kinases，RLKs）可以識(shí)別和傳遞信號(hào)，響應(yīng)植物的生物脅迫及非生物脅迫。因此，研究RLK與柱花草抗寒的分子機(jī)制，提高柱花草抗冷性，對(duì)柱

2、花草推廣生產(chǎn)具有重要意義。
　　本文對(duì)柱花草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，選取兩個(gè)類(lèi)受體蛋白激酶（RLK）進(jìn)行克隆分析。主要采用 PCR方法克隆 SgLRPK及 SgCRK的部分片段，通過(guò) RACE及hiTAIL-PCR的方法擴(kuò)增已知片段的兩端未知序列，序列拼接獲得完整編碼區(qū)。結(jié)果表明，SgLRPK基因ORF全長(zhǎng)1812bp，編碼604個(gè)氨基酸，胞外具有一段保守的LRR重復(fù)序列，一個(gè)跨膜區(qū)以及胞內(nèi)激酶區(qū)。SgCRK基因cDNA全長(zhǎng)861b

3、p，編碼287個(gè)氨基酸，具有兩個(gè)未知功能區(qū)域DΜF(xiàn)26。
　　將SgLRPK及SgCRK完整編碼區(qū)裝載到帶35S啟動(dòng)子的表達(dá)載體pCambia3301上，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體。另外將SgLRPK基因的兩個(gè)打靶位點(diǎn)連接CRISPR/Cas9，構(gòu)建打靶載體。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將載體幾個(gè)載體轉(zhuǎn)化柱花草184，分別獲得過(guò)表達(dá)SgLRPK的轉(zhuǎn)基因柱花草6株，其中4株為陽(yáng)性植株；過(guò)表達(dá)SgCRK的轉(zhuǎn)基因柱花草4株，其中3株為陽(yáng)性植株；打靶干涉SgLRP

4、K表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因柱花草18株，其中10株為陽(yáng)性植株。
　　通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，隨著低溫脅迫的進(jìn)行，柱花草體內(nèi)SgLRPK基因及SgCRK基因的相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低的趨勢(shì)。低溫處理下，SgLRPK基因表達(dá)在前12h呈上升趨勢(shì)，在12h處最高，約處理前6倍，在24h后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但仍較處理前高。SgCRK基因的相對(duì)表達(dá)量在處理24h處最高，達(dá)到處理前的8倍左右，隨后出現(xiàn)下降。低溫處理能夠提高兩個(gè) RLK的相對(duì)表達(dá)，表