平潭水仙組培快繁和抗病基因的克隆與轉(zhuǎn)化.pdf

1、中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis M. Roem.）屬石蒜科，水仙屬，著名觀賞植物物種，型色香獨特，極具觀賞價值，長久以來為十大名花之一。我國水仙主要分布在福建和浙江等地，福建水仙生產(chǎn)地位尤為突出，平潭島水仙花資源豐富，獨具特色，以“花期長、香味持久、植株矮壯”的三大特點著稱，且人工馴化時間不長，在觀賞品質(zhì)培育方面可塑性更強。本實驗以平潭水仙為材料，建立高效的組織快繁體系；成功從平潭水仙中克隆了

2、兩個抗病基因，即幾丁質(zhì)酶基因和葡聚糖酶基因，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行了基因轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因平潭水仙植株材料。主要研究結(jié)果如下。
　　1、子房誘導(dǎo)愈傷組織途徑：以子房為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織速度快、質(zhì)量好；可以較好的分化形成小鱗莖。本實驗對含不同配比的6-BA和2,4-D的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行了篩選，在以子房為外植體的情況下可以誘導(dǎo)出2種不同類型的愈傷組織，黃色褶皺型和混合型，后者更為常見；實驗中所設(shè)計的不同配方培養(yǎng)基均可誘愈傷組織的

3、形成，其中MS+0.75 mg/L6-BA+0.5 mg/L2,4-D誘導(dǎo)率最高，可達79.2％；MS+5.0 mg/L6-BA+0.3 mg/L NAA愈傷組織分化率最高，可達42.4%，分化系數(shù)為2.07；MS+1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L2,4-D+0.2 mg/L NAA愈傷組織分化率為30.3%，分化系數(shù)高達3.18，且小鱗莖分化質(zhì)量較好；分化過程中會出現(xiàn)組織褐化和小鱗莖玻璃化等異常現(xiàn)象。
　　2、鱗莖盤直

4、接誘導(dǎo)途徑：以平潭水仙鱗莖盤為外植體進行不定芽誘導(dǎo)，實驗中對外植體消毒時間和消毒試劑NaClO的濃度進行了篩選，以6-BA、2,4-D、NAA為變量設(shè)計誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。結(jié)果顯示：選用側(cè)球，用30%的NaClO消毒35 min，污染率較低，為39.1%；添加1.0 mg/L6-BA和0.1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)鱗莖盤產(chǎn)生不定芽的效果最好，63%的外植體可成功分化，分化系數(shù)為6.6；實驗中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)形成小鱗莖的大小依據(jù)不同培養(yǎng)基配

5、方而異；每組培養(yǎng)基中的鱗片都會有不同程度的生長異常，鱗莖盤的繼代培養(yǎng)效果不佳。
　　3、花葶直接誘導(dǎo)途徑：以平潭水仙花葶為外植體可直接誘導(dǎo)形成不定芽，含5m g/L6-BA和0.2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基對花葶不定芽的誘導(dǎo)效果最好，MS+4mg/L6-BA+0.2mg/L NAA培養(yǎng)基中可促進分化的幼苗正常生長。
　　4、平潭水仙抗病基因的克?。阂罁?jù)中國水仙轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，運用RT-PCR技術(shù)從平潭水仙中克隆了葡聚糖酶

6、基因和幾丁質(zhì)酶基因；葡聚糖酶基因的ORF為：1887bp，共編碼628個氨基酸，具有Glyco-hydro-9結(jié)構(gòu)域；幾丁質(zhì)酶基因ORF為：918bp，編碼305個氨基酸，具有Chitinase-Glyco-hydro-19結(jié)構(gòu)域。
　　5、平潭水仙抗病基因的轉(zhuǎn)化：利用In-Fusion技術(shù)構(gòu)建表達載體pBI121-glucanase和pBI121-chitinase，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其分別導(dǎo)入平潭水仙，通過提取抗性組織DNA進行