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文檔簡介
1、血小板生成因子(TPO)是一個非常重要的造血調(diào)控因子。經(jīng)過幾十年的不懈努力,基本上闡明了血小板生成因子及其受體系統(tǒng)(TPO/c-Mpl)在造血調(diào)控方面的作用,并在此基礎(chǔ)上,研制了重組人血小板生成因子(rhTPO),以治療放療和化療等引起的血小板減少癥。研究表明TPO是促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖、分化、成熟以及血小板產(chǎn)生的最基本的調(diào)控因子。此外,TPO可單獨作用于原始造血干細(xì)胞和巨核細(xì)胞潛能的造血祖細(xì)胞,保護(hù)其生長,擴(kuò)增其數(shù)量,并可與干細(xì)胞生長因子
2、(SCF)、白介素11(IL-11)和紅細(xì)胞生成素(EPO)等其它造血生長因子協(xié)同作用于造血祖細(xì)胞,促進(jìn)其增殖。 本試驗首先觀察了國產(chǎn)重組人血小板生成因子(rhTPO)對輻射引起的C57小鼠骨髓抑制的治療作用;然后觀察了rhTPO對用環(huán)磷酰胺后獼猴的骨髓有核細(xì)胞增生情況的影響;并進(jìn)一步利用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和透射電鏡等方法研究rhTPO對輻射所致MO7e細(xì)胞凋亡的影響來探討其調(diào)控造血系統(tǒng)的可能的機(jī)制。 一.rhTPO對
3、輻射所致C57小鼠骨髓抑制的影響 雄性C57小鼠75只,經(jīng)塢<'137>銫γ射線4 Gy單次全身輻射,造成骨髓抑制。于輻射前及輻射后不同時間采血,測定血小板計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)和血紅蛋白量。根據(jù)輻射前血小板計數(shù)分層,小鼠隨機(jī)分成5組:溶媒對照組,rhIL-11組,rhTPO低、中、高劑量組。在全身輻射后第5天開始,分別皮下注射給予檸檬酸緩沖液,rhIL-11 150 μg·kg<'-1>, rhTPO 4.5, 9和18μg·kg<
4、'-1>,每天給藥1次(rhIL-11分兩次給藥),連續(xù)給藥22天,給藥容積為10 mL·kg<'-1>。實驗結(jié)束后稱體重,頸椎脫臼處死小鼠,取脾臟和一側(cè)股骨,稱脾臟重量,計算脾重/體重比,并用紫外分光光度法測定骨髓DNA含量。結(jié)果顯示給藥第8天開始到實驗結(jié)束(給藥第22天),rhIL-11組, rhTPO 4.5, 9和18μg·kg<'-1>組小鼠血小板計數(shù)增加幅度明顯大于對照組(P<0.01);其中,rhTPO 9和18μg·kg
5、<'-1>組的增幅較rhTPO4.5μg·kg<'-1>和rhIL-11組大(P<0.01)。在給藥第22天,rhTPO 18μg·kg<'-1>組的增幅較rhTPO 9μg·kg<'-1>組大(P<0.01)。給藥第15和22天,IL-11組小鼠白細(xì)胞計數(shù)增加幅度明顯大于對照組(P<0.01),而rhTPO 4.5和9μg·kg<'-1>組小鼠在給藥第22天時其白細(xì)胞計數(shù)的增幅才比對照組明顯增加(P<0.01,P<0.05)。rhTP
6、O 4.5,9和18μg·kg<'-1>組小鼠脾臟重量和脾重/體重比與對照組比較無明顯差異(P>0.05)。rhTPO 9μg·kg<'-1>組小鼠骨髓DNA含量比對照組明顯增加(P<0.05)。 二.rhTPO對用環(huán)磷酰胺后獼猴骨髓細(xì)胞的影響 獼猴20只,靜脈注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg,每天1次,連續(xù)2天,造成骨髓抑制。隨機(jī)分成4組:溶媒對照組,rhIL-11組,rhTPO低和高劑量組。用環(huán)磷酰胺后第3天開始,分別皮
7、下注射給予檸檬酸緩沖液,rhIL-11 62.5μg·kg<'-1>,rhTPO 3和9CC,每天給藥1次,連續(xù)給藥20天,給藥容積為0.1 mL·kg<'-1>。給藥第22天肌內(nèi)注射氯胺酮麻醉動物,無菌條件下抽取骨髓,做骨髓涂片,常規(guī)瑞氏染色,進(jìn)行分類,拍照。骨髓涂片顯示rhIL-11組,rhTPO低和高劑量組獼猴骨髓象中粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞三系增生均活躍,巨核細(xì)胞數(shù)量增多,以成熟型為主,血小板成堆多見,rhTPO的作用強(qiáng)度與其劑
8、量相關(guān)。 三.rhTPO對輻射引起MO7e細(xì)胞凋亡的影響 1.rhTPO對輻射后MO7e細(xì)胞存活率的影響: MO7e細(xì)胞經(jīng)<'137>銫γ射線5 Gy輻射造模后,隨機(jī)分成5組,分別與培養(yǎng)液,GM-CSF(10 μg/L)和rhTPO(1,10,μg/L)共同孵育0、24、48和72 h,通過MTT法測定OD值,計算MO7e細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示輻射后24和48 h,rhTPO 10,100μg/L組和GM-CSF
9、組細(xì)胞存活率均明顯高于輻射對照組(P<0.01,P<0.05),輻射后72 h,rhTPO 100μg/L組細(xì)胞存活率仍明顯高于輻射對照組(P<0.01)。其中rhTPO 100μg/L組在輻射后24,48和72 h的細(xì)胞存活率顯著高于rhTPO 10μg/L組(P<0.01,P<0.05);在輻射后48和72 h的細(xì)胞存活率也明顯高于GM-CSF組(P<0.01,P<0.05)。 2.rhTPO對輻射后MO7e細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞
10、周期分布的影響: 另取MO7e細(xì)胞,經(jīng)<'137>銫γ射線5 Gy輻射造模后,隨機(jī)分成4組,分別與培養(yǎng)液,GM-CSF(10μg/L)和rhTPO(10,100μg/L)共同孵育24、36和48 h,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布;透射電鏡觀察MO7e細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示輻射后36 h,rhTPO 10,100μg/L組和GM-CSF組細(xì)胞凋亡率均較輻射對照組顯著降低(P<0.01),并且rhTPO 100
11、μg/L組比rhTPO 10μg/L組效果更明顯(P<0.01)。輻射后36 h,與正常培養(yǎng)的細(xì)胞相比,輻射對照組處于G<,0>/G<,1>期細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01),G<,2>/M期、S期的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05,P<0.01);而GM-CSF組和rhTPO 100μg/L組處于G<,0>/G<,1>期細(xì)胞數(shù)均較輻射對照組顯著減少(P<0.01),GM-CSF組和rhTPO 100μg/L組之間無顯著性差異(P>0.05)
12、。輻射后24 h,MO7e細(xì)胞呈現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化,表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮??;表面微絨毛消失;核染色質(zhì)固縮聚集于核膜周邊,呈不規(guī)則塊狀或新月狀;但細(xì)胞膜和細(xì)胞器均完整。 上述結(jié)果提示皮下注射給予rhTPO 4.5,9和18μg·kg<'-1>,能劑量依賴性升高輻射后C57小鼠的外周血小板數(shù)目,促進(jìn)輻射后C57小鼠白細(xì)胞計數(shù)的恢復(fù),增加輻射后C57小鼠骨髓DNA含量。它升高血小板作用比rhIL-11強(qiáng)而起效快;升高白細(xì)胞作用比rh
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