硫營(yíng)養(yǎng)對(duì)PXO99A致病毒素及磺基轉(zhuǎn)移酶RaxST合成的影響.pdf

1、硫(S)是繼氮(N)、磷(P)、鉀(K)之后第四位必不可少的生命元素。硫代謝是PXO99A體內(nèi)重要的代謝途徑，在合成致病毒素和無(wú)毒因子過(guò)程中起著重要作用。應(yīng)用抗毒素篩選體系培育抗性植株和以無(wú)毒因子作為藥物靶標(biāo)應(yīng)用于水稻白葉枯病防治是重要的研究方向。
　　本研究采用乙酸乙酯法分離、提取硫梯度處理的PXO99A致病毒素，并對(duì)其進(jìn)行生物毒性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在4mM濃度范圍內(nèi)，硫濃度越高，越有利于PXO99A致病毒素的合成，其毒力越強(qiáng)

2、。水稻品種CX6221B比D62B對(duì)PXO99A毒素表現(xiàn)出較高的抗病性。該毒素對(duì)水稻露白種子胚根的生長(zhǎng)抑制率明顯高于胚芽，對(duì)胚根與胚芽的毒害作用隨毒素濃度的增加而加強(qiáng)。當(dāng)粗毒素濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，毒素對(duì)胚芽胚根的生長(zhǎng)起完全抑制作用。
　　構(gòu)建pSKB4-RaxST-ECFP質(zhì)粒載體，采用電轉(zhuǎn)化方法獲得PXO99A-RaxST-ECFP重組菌株并鑒定，最后熒光檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)期的RaxST成量不同，其中對(duì)數(shù)

3、生長(zhǎng)期的RaxST表達(dá)量最多。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著硫濃度的增大，RaxST合成量逐漸增大，從而影響無(wú)毒因子的硫酸化;低濃度的硫會(huì)減少RaxST的合成。
　　另一方面，通過(guò)分析RaxST序列，克隆、表達(dá)、純化獲得fRaxST-MBP(全序列的RaxST)、tnRaxST-MBP(去掉N端的RaxST)、tcRaxST-MBP(去掉C端的RaxST)和tcnRaxST-MBP(去掉N端和C端的RaxST)共四種融合蛋白。利用人工合成

4、的四種多肽(10肽、15肽、17肽、21肽)為底物，對(duì)RaxST進(jìn)行了酶學(xué)分析。結(jié)果表明，fRaxST-MBP對(duì)10肽、15肽、17肽、21肽的kcat、Km和Ki分別為:6.13 s-1、1.36 mmol/L和0.01 mmol/L;0.51 s-1、0.47 mmol/L和0.49 mmol/L;0.12 s-1、0.03 mmol/L和1.72 mmol/L;0.04 s-1、0.01 mmol/L和0.01 mmol/L。tc

5、RaxST-MBP對(duì)10肽、15肽、17肽、21肽的kcat、Km和K汾別為:0.37 s-1、0.13 mmol/L和1.94mmol/L;1.25 s-1、0.26 mmol/L和0.10 mmol/L;0.97 s-1、0.14 mmol/L和0.07 mmol/L;0.75 s-1、0.03 mmol/L和0.02 mmol/L。tnRaxST-MBP對(duì)10肽、15肽、17肽、21肽的kcat、Km和Ki分別為:0.14 s-1

6、、0.16 mmol/L和0.92 mmol/L;6.23 s-1、4.89 mmol/L和0.02 mmol/L;0.45 s-1、0.04 mmol/L和0.21 mmol/L;0.18 s-1、0.01 mmol/L和0.14mmol/L。tcnRaxS個(gè)-MBP對(duì)10肽、15肽、17肽、21肽的kcat、Km制Ki分別為:0.25s-1、0.11 mmol/L和1.05 mmol/L;65.3 s-1、4.20 mmol/L和0