水稻白葉枯病菌磺基轉(zhuǎn)移酶RaxST的活性分析.pdf

1、水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)是一種革蘭氏陰性病原菌，可誘發(fā)水稻產(chǎn)生白葉枯病，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量。深入研究不同白葉枯病菌小種的發(fā)病特點(diǎn)和致病原理，對(duì)于培育抗病水稻品種，進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量具有重大意義。
　　Xoo的P6小種(PXO99)不能使含抗病基因Xa2Ⅰ的水稻感病，卻會(huì)使不含Xa21的水稻感病，說明水稻細(xì)胞的Xa21能特異識(shí)別PXO99的MAMPs。研究者從PXO99的外泌成分

2、中分離得到了PXO-03968的N端和C端，通過分析其蛋白序列，人工合成酪氨酸硫酸化的多肽axYs22，發(fā)現(xiàn)Xa21可與此多肽相互作用，并且Tyr硫酸化是axY22誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生抗性所必須的。研究發(fā)現(xiàn)在PXO99中，催化其Tyr硫酸化的是磺基轉(zhuǎn)移酶RaxST，以3'磷酸腺苷-5磷酰硫酸(PAPS)為底物，催化PXO-03968或其N端多肽的硫酸化。
　　本研究中，我們克隆、表達(dá)、純化了來自PXO99的RaxST，并對(duì)其進(jìn)行了酶學(xué)分析

3、。分析RaxST序列發(fā)現(xiàn)，其N端存在一段28個(gè)氨基酸的疏水序列。疏水序列的存在可能會(huì)使RaxST易與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)合，可能影響RaxST蛋白的純化及活性發(fā)揮。因此實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了含全長RaxST(fRaxST)的表達(dá)載體pET24a-KanP-RaxST、pMALC2E-fRaxST及去掉疏水端序列RaxST(tRaxST)表達(dá)載體pMALC2E-tRaxST。將pET24a-KanP-RaxST質(zhì)粒載體利用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入感受態(tài)PX

4、O99，經(jīng)Kan抗性篩選得到陽性重組菌株;將pMALC2E-fRaxST及pMALC2E-tRaxST質(zhì)粒載體利用熱激法轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)。分別利用白葉枯病菌和大腸桿菌表達(dá)不同類型的RaxST，用相應(yīng)的親和層析法純化得到相應(yīng)的fRaxST及tRaxST。
　　PXO-03968(Ax21)、其N端axY22多肽或者更小的多肽均可能是其底物，所以RaxST硫酸化作用的底物并不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了Ax21的原

5、核表達(dá)載體pMALC2E-PXO-03968，熱激法轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)并純化得到了PXO-03968蛋白。我們利用人工合成的axY22、八肽(AENLSYNF)以及Ax21為底物，對(duì)RaxST進(jìn)行了酶學(xué)分析。
　　利用我們實(shí)驗(yàn)室建立的酶活測定方法，分別測定RaxST催化不同反應(yīng)底物的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。結(jié)果表明PXO99表達(dá)的fRaxST對(duì)17肽axY22的Vm和Km分別為:10.5（±0.5）μM/min和