載復(fù)合生長因子緩釋微球?qū)M織工程心臟瓣膜種子細(xì)胞的調(diào)控.pdf

1、目的：
　　1.找出制備有良好載藥率、包封率及載生長因子微球緩釋系統(tǒng)的可行方法。
　　2.研究微球緩釋系統(tǒng)釋藥特性，找出促進(jìn)種子細(xì)胞生長所需的生長因子濃度。
　　3.研究載復(fù)合生長因子納米微球緩釋系統(tǒng)是否能提高細(xì)胞的增殖及分泌能力，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，是否能提高種子細(xì)胞在去細(xì)胞支架的粘附能力。
　　方法：
　　1.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及表型鑒定：采用percoll密度梯度離心法對SD大鼠骨髓進(jìn)行分

2、離培養(yǎng)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定MSCs細(xì)胞周期、及表面抗原CD34、CD44、CD45表型鑒定。
　　2.不同生長因子對MSC增殖、粘附功能影響研究：對MSCs分別加入含濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200ng?mL-1的bFGF、PDGF或bFGF+PDGF復(fù)合生長因子培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2及飽和濕度條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)24、48、96、144h。采用CCK-8測定種子細(xì)胞增殖情況，計數(shù)法測定細(xì)胞粘

3、附情況，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期和凋亡率，檢測MSCsⅠ、Ⅲ型膠原分泌情況。最終確定PDGF-BB和bFGF兩者之間的最佳濃度比例。
　　3.微球緩釋系統(tǒng)的制備：采用改良的乳液聚合法制得一系列粒徑DEX-GMANPs緩釋系統(tǒng)（DG-NPs），并通過對反應(yīng)條件的優(yōu)選尋找最佳制備微球的反應(yīng)條件，選取能達(dá)到所需載藥量及緩釋作用的微球粒徑。
　　4.載復(fù)合生長因子微球緩釋系統(tǒng)對MSC增殖、粘附功能的影響研究：分為bFGF緩釋微球組、

4、PDGF緩釋微球組、bFGF+PDGF復(fù)合緩釋微球組分別加入0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200ng?mL-1的bFGF緩釋微球、PDGF緩釋微球、bFGF+PDGF復(fù)合緩釋微球至第三代種子細(xì)胞，37℃、5％CO2及飽和濕度條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)24、48、96、144h，與相應(yīng)的bFGF、PDGF、bFGF+PDGF及空白組對照，采用計數(shù)法測定細(xì)胞粘附情況，CCK-8測定種子細(xì)胞增殖情況，Westonblot檢測MS

5、CsⅠ、Ⅲ型膠原分泌情況。流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面抗原特性。
　　結(jié)果：
　　1.于大鼠股骨中取得的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)三次傳代培養(yǎng)，形態(tài)良好，數(shù)量可達(dá)到107細(xì)胞數(shù)量級，能滿足組織工程種子細(xì)胞的需求。
　　2.發(fā)現(xiàn)bFGF和PDGF對MSCs的增殖促進(jìn)作用明顯，24h內(nèi)3.125ng·mL-1bFGF（?值：0.18±0.01）已與空白組（?值：0.12±0.02）產(chǎn)生顯著差異（p＜0.05），且在濃度低于100ng?mL

6、-1呈明顯濃度依賴趨勢。100ng·mL-1的bFGF和PDGF對MSCs的增殖促進(jìn)作用最強(qiáng)。同樣對于細(xì)胞黏附bFGF和PDGF也有明顯的促進(jìn)作用，兩者也均呈明顯濃度依賴趨勢。與同劑量單純bFGF、PDGF相比bFGF+PDGF復(fù)合生長因子對于MSCs的增殖和粘附均有更顯著的促進(jìn)作用（p均＜0.01）。
　　3.制備的微球緩釋系統(tǒng)，乳化劑與投藥量比為1:25，攪拌速率為200rpm時，改良乳液聚合法制備緩釋凝膠微球，微球圓整表面光

7、滑，大小均勻，微球凍干粉為淡白色疏松粉末，包封率88.2％，初始24h突釋達(dá)60％，之后持續(xù)緩釋效果達(dá)30d，且對細(xì)胞無毒副作用。
　　4.bFGF緩釋系微球與單純bFGF組對比：24h濃度25ng·mL-1時對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用bFGF微球組（0.17±0.01），bFGF組（0.19±0.02）已與空白微球組（0.13±0.02）產(chǎn)生顯著差異（p<0.05）；48h內(nèi)，bFGF微球組對MSCs增殖促進(jìn)作用與bFGF組差別無統(tǒng)計

8、意義（p>0.05）；96h劑量25ng·mL-1以上時，bFGF微球組對MSCs增殖的促進(jìn)作用顯著高于單純bFGF組（p<0.05）。
　　5.PDGF緩釋系微球與單純PDGF對MSCs增殖的對比：培養(yǎng)24h，濃度6.25ng·mL-1時，PDGF微球組（0.15±0.01），單純PDGF組（0.16±0.01）已與空白微球組（0.13±0.02）對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用產(chǎn)生顯著差異（p<0.05）；48h內(nèi)PDGF微球組對MSCs

9、增殖促進(jìn)作用與單純PDGF無顯著差異（p>0.05）；96h劑量6.25ng·mL-1以上時，PDGF微球組對MSCs增殖的促進(jìn)作用顯著高于單純PDGF組（p<0.05）。
　　6.bFGF+PDGF緩釋微球促M(fèi)SCs增殖對比：培養(yǎng)144h后，50ng·mL-1以上濃度bFGF+PDGF緩釋微球組對MSCs的增殖促進(jìn)作用明顯高于非緩釋bFGF+PDGF復(fù)合因子組（p<0.05）。24、48h，50和100ng·mL-1時，bFGF

10、+PDGF復(fù)合緩釋微球組對細(xì)胞增殖的促進(jìn)明顯高于bFGF緩釋微球組（p<0.05），24h、12.5ng·mL-1至100ng·mL-1及48h以上各濃度以及96h和144h低于200ng·mL-1濃度時，bFGF+PDGF緩釋微球組對MSCs的增殖促進(jìn)效果顯著優(yōu)于單純PDGF緩釋微球組（p<0.05）。
　　7.緩釋微球與非緩釋微球組對24h細(xì)胞粘附功能的影響：在濃度6.25ng·mL-1至100ng·mL-1之間，對于細(xì)胞的粘

11、附均有促進(jìn)作用（p<0.05），但緩釋微球與非緩釋微球組對比無顯著差異（p>0.05）。bFGF+PDGF復(fù)合緩釋微球比單純PDGF和單純的bFGF緩釋微球相比對細(xì)胞粘附的影響有顯著差異。bFGF+PDGF復(fù)合緩釋微球組在各時間點(diǎn)對細(xì)胞粘附的促進(jìn)效果顯著優(yōu)于同劑量單純生長因子微球組（p<0.05）。
　　8.各生長因子組I型III型膠原分泌的影響：bFGF+PDGF復(fù)合緩釋微球組I型膠原（26.79±2.58）III型膠原（26.

12、54±1.81），bFGF+PDGF復(fù)合組I型膠原（13.18±2.12），III型膠原（16.82±1.56）均顯著高于相對應(yīng)的空白微球?qū)φ战MI型膠原(4.01±0.64)III，型膠原（4.76±0.56）和空白對照組I型膠原(3.16±0.55)，III型膠原(4.72±0.36）（p<0.01）。同時bFGF+PDGF復(fù)合緩釋微球組的I型膠原、III型膠原分泌值，也顯著高于單純bFGF+PDGF復(fù)合組（p<0.05）。
　

13、　結(jié)論：
　　1.本研究制得微球表面光滑圓整，球體大小均勻，我們采取200rpm攪拌速率獲得的微球，平均粒徑為20-40μm。并且具有滿意的緩釋作用及載藥量。早期的突釋可以使藥物快速達(dá)到所需峰值濃度，且微球?qū)ιL因子的保護(hù)性良好，可使生長因子長期持續(xù)作用于細(xì)胞。
　　2.找到了生長因子bFGF、PDGF與MSCs的增殖與粘附的量效關(guān)系，可在組織工程心臟瓣膜的構(gòu)建過程中根據(jù)需要加入復(fù)合生長因子DG-NPs，使種子細(xì)胞維持分化能

14、力的時期延長，增殖能力提升，I型膠原、III型膠原的泌合成顯著增加，細(xì)胞粘附力增強(qiáng)。
　　3.bFGF和PDGF緩釋微球?qū)SCs的增值和粘附均有促進(jìn)作用，96h濃度25ng·mL-1以上時bFGF微球組對MSCs增殖的促進(jìn)作用高于bFGF組，96h劑量6.25ng·mL-1以上濃度PDGF微球組對MSCs增殖的促進(jìn)作用高于單純PDGF組。
　　4.復(fù)合生長因子緩釋微球培養(yǎng)144h后、50ng·mL-1以上濃度時，bFGF+

15、PDGF緩釋微球組對MSCs的增殖促進(jìn)作用明顯高于非緩釋bFGF+PDGF復(fù)合因子組。同時間各濃度，bFGF+PDGF緩釋微球組對MSCs的增殖促進(jìn)效果均顯著優(yōu)于bFGF緩釋微球；24h、12.5ng·mL-1濃度以上，以及48h以上各濃度bFGF+PDGF緩釋微球組對MSCs的增殖促進(jìn)效果顯著優(yōu)于單純PDGF緩釋微球組。
　　5.bFGF+PDGF復(fù)合生長因子微球與單純PDGF和單純的bFGF緩釋微球相比對細(xì)胞粘附的影響有顯著差