復(fù)合材料體外動(dòng)態(tài)構(gòu)建組織工程心臟瓣膜及其鈣化機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 RGD-PEG-去細(xì)胞瓣復(fù)合材料的構(gòu)建
　　第一節(jié):PEG交聯(lián)去細(xì)胞瓣
　　目的:PEG交聯(lián)去細(xì)胞瓣構(gòu)建 PEG-去細(xì)胞瓣材料。
　　方法:合成枝化狀 PEG,利用SATA法在去細(xì)胞瓣上引入巰基,通過(guò)邁克爾加成反應(yīng),構(gòu)建 PEG交聯(lián)去細(xì)胞瓣材料。生物力學(xué)測(cè)試交聯(lián)對(duì)支架材料力學(xué)性能的影響。
　　結(jié)果:PEG交聯(lián)去細(xì)胞瓣構(gòu)建條件溫和易控,交聯(lián)效果確切;PEG-去細(xì)

2、胞瓣材料抗拉強(qiáng)度明顯高于單純?nèi)ゼ?xì)胞瓣(7.53±032 Mpa vs.5.65±0.28 Mpa,P<0.05),與天然瓣膜抗拉強(qiáng)度相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:通過(guò)邁克爾加成反應(yīng),PEG可成功交聯(lián)去細(xì)胞瓣,構(gòu)建與天然瓣膜抗拉強(qiáng)度相似的PEG-去細(xì)胞瓣材料。
　　第二節(jié):構(gòu)建 RGD-PEG-去細(xì)胞瓣復(fù)合材料
　　目的:PEG-去細(xì)胞瓣材料共價(jià)接枝 GRGDSPC肽,構(gòu)建 RGD-PEG-去細(xì)胞瓣

3、復(fù)合材料。
　　方法:PEG-去細(xì)胞瓣與1ml GRGDSPC肽溶液在37℃發(fā)生邁克爾加成反應(yīng),分光光度法檢測(cè)復(fù)合材料結(jié)合 GRGDSPC肽質(zhì)量,并行免疫熒光定性檢測(cè)。
　　結(jié)果:GRGDSPC肽能有效地結(jié)合于 PEG-去細(xì)胞瓣,免疫熒光法檢測(cè)證實(shí) GRGDSPC肽與 PEG-去細(xì)胞瓣有效共價(jià)接枝。
　　結(jié)論:PEG-去細(xì)胞瓣材料能夠在體外有效地結(jié)合 GRGDSPC肽,構(gòu)建 RGD-PEG-去細(xì)胞瓣復(fù)合材料。
　

4、　第二部分 生物反應(yīng)器系統(tǒng)的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建生物反應(yīng)器系統(tǒng),并對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行流量和生物相容性測(cè)試。
　　方法：通過(guò)保定蘭格 WT600-1F蠕動(dòng)泵,生物反應(yīng)器流室,硅膠管道和儲(chǔ)液室構(gòu)建生物反應(yīng)器系統(tǒng)。生物反應(yīng)器流室內(nèi)植入 RGD-PEG-去細(xì)胞瓣復(fù)合材料,測(cè)試不同流量下系統(tǒng)工作狀態(tài)及生物相容性。
　　結(jié)果：生物反應(yīng)器通過(guò)蠕動(dòng)泵產(chǎn)生脈動(dòng)流,能夠有效模擬體內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)環(huán)境。精確調(diào)控生物反應(yīng)器的流量,可以對(duì) TEHV施加不同

5、大小的剪切應(yīng)力刺激。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建生物反應(yīng)器系統(tǒng),通過(guò)對(duì)流量的精確調(diào)控,可以實(shí)現(xiàn)不同大小的剪切應(yīng)力刺激。
　　第三部分 復(fù)合材料體外動(dòng)態(tài)構(gòu)建組織工程心臟瓣膜及其鈣化機(jī)制研究
　　第一節(jié)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:分離、培養(yǎng)、鑒定瓣膜間質(zhì)細(xì)胞。
　　方法:膠原酶消化法分離瓣膜中間質(zhì)細(xì)胞,在含10％FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng),通過(guò)免疫熒光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:通過(guò)膠原酶消化法可成功從人主動(dòng)

6、脈瓣中分離出瓣膜間質(zhì)細(xì)胞。原代培養(yǎng)的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞單層生長(zhǎng),形態(tài)呈梭形,放射狀排列,隨數(shù)量增長(zhǎng)相互連接成片,5-7天匯合成單層。細(xì)胞鑒定α平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)免疫熒光染色陽(yáng)性,波形蛋白(vimentin)免疫熒光染色陽(yáng)性。
　　結(jié)論:膠原酶消化法簡(jiǎn)單易行,可成功分離出瓣膜中的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞。瓣膜間質(zhì)細(xì)胞增殖能力強(qiáng),可作為組織工程瓣膜理想的種子細(xì)胞。
　　第二節(jié) 復(fù)合材料生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建組織工程心臟瓣膜
　　目的:R

7、GD-PEG-去細(xì)胞瓣復(fù)合材料上種植瓣膜間質(zhì)細(xì)胞,生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建組織工程心臟瓣膜。
　　方法:RGD-PEG-去細(xì)胞瓣復(fù)合材料上種植瓣膜間質(zhì)細(xì)胞,生物反應(yīng)器內(nèi)體外動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。接細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)第2h、4h、8h細(xì)胞黏附情況,第10天后行形態(tài)學(xué)觀察和DNA含量測(cè)定。
　　結(jié)果:細(xì)胞黏附計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)觀察提示,RGD-PEG-去細(xì)胞瓣復(fù)合材料明顯促進(jìn)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞黏附,并形成連續(xù)單層細(xì)胞覆蓋。DNA含量測(cè)定提示種植細(xì)胞后RGD-PEG

8、-去細(xì)胞瓣復(fù)合材料較單純?nèi)ゼ?xì)胞瓣組和PEG-去細(xì)胞瓣組明顯增高(25.98±2.45μg/瓣葉 vs.19.61±1.94μg/瓣葉 vs.18.40±1.89μg/瓣葉,P<0.05)。
　　結(jié)論:生物反應(yīng)器內(nèi) RGD-PEG-去細(xì)胞瓣復(fù)合材料,可促進(jìn)種子細(xì)胞的黏附,改善瓣膜支架生物學(xué)性能。
　　第三節(jié):阻斷 Notch-1信號(hào)通路誘導(dǎo)組織工程心臟瓣膜鈣化
　　目的:RGD-PEG-去細(xì)胞瓣復(fù)合材料上種植瓣膜間質(zhì)細(xì)胞

9、構(gòu)建組織工程心臟瓣膜,阻斷 Notch-1信號(hào)通路,生物反應(yīng)器內(nèi)動(dòng)態(tài)培養(yǎng),誘導(dǎo)鈣化。
　　方法:3-8代的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入γ-分泌酶抑制劑 DAPT,阻斷 Notch-1信號(hào)通路,每三至四天換液,共干預(yù)3周。種植于 RGD-PEG-去細(xì)胞瓣復(fù)合材料,生物反應(yīng)器內(nèi)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)10天。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)作為陰性對(duì)照組。含甘油磷酸、維生素 C、地塞米松的鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)作為陽(yáng)性對(duì)照組。茜素紅染色觀察鈣沉積。RT-PCR檢測(cè)α-平滑肌動(dòng)蛋白

10、、核心結(jié)合因子、骨鈣素等鈣化相關(guān)因子表達(dá)。Western blot法檢測(cè)核心結(jié)合因子、骨鈣素、骨橋蛋白等鈣化相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組茜素紅染色陽(yáng)性。RT-PCR提示實(shí)驗(yàn)組α-平滑肌動(dòng)蛋白、核心結(jié)合因子、骨鈣素等表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。Western blot提示實(shí)驗(yàn)組核心結(jié)合因子、骨鈣素、骨橋蛋白等鈣化相關(guān)蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。
　　結(jié)論:通過(guò)γ-分泌酶抑制劑 DAPT阻斷