可注射鑲嵌載生長因子殼聚糖微球的PLGA多孔復(fù)合微球支架的研究.pdf

1、骨缺損是臨床上的常見病癥，常規(guī)的治療方法主要包括自體骨移植和異體骨移植，前者有骨來源少，供骨部位易出血和感染細(xì)菌等問題，而后者有病毒感染和免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。近年來，采用骨組織工程學(xué)修復(fù)骨缺損的研究得到了廣泛的關(guān)注。組織工程學(xué)是應(yīng)用工程學(xué)、生物學(xué)和化學(xué)的原理與方法，修復(fù)或重建受損的組織和器官，包括血管、骨、軟骨、皮膚和神經(jīng)等。骨組織工程學(xué)利用組織工程支架、種子細(xì)胞和生長因子，模擬三維微環(huán)境，形成有利于細(xì)胞增殖、分化和新組織形成的平臺(tái)，并可移

2、植入骨缺損部位進(jìn)行組織再生。
　　PLGA多孔微球支架(PLGA-pMS)是一種優(yōu)秀的可注射支架，具有創(chuàng)傷小、病人適應(yīng)性強(qiáng)和可填充不規(guī)則缺損等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究發(fā)現(xiàn)，PLGA-pMS在兩方面有待優(yōu)化。(1) PLGA-pMS的細(xì)胞親和性較差。PLGA是親脂性聚合物，導(dǎo)致PLGA-pMS的親水性差;PLGA的結(jié)構(gòu)中也沒有供細(xì)胞識(shí)別的位點(diǎn)。兩者導(dǎo)致種子細(xì)胞不能有效地粘附在微球表面。目前，PLGA-pMS的修飾改性方法主要是在

3、微球表面沉積磷灰石，但該方法操作復(fù)雜，持續(xù)時(shí)間長，并且對(duì)載藥PLGA-pMS有不利影響。(2) PLGA-pMS中的藥物釋放過快。非多孔的PLGA微球是常用的藥物緩釋載體，體外藥物釋放一般可達(dá)到一個(gè)月以上，而PLGA-pMS的多孔結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了明顯的突釋和較短的緩釋時(shí)間，過快的藥物釋放不利新組織的形成。在組織工程領(lǐng)域，作為支架的載生長因子的PLGA-pMS尚未報(bào)道。
　　本課題在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，旨在改善PLGA-pMS的細(xì)胞

4、親和性，并使其具備緩釋生長因子的能力。因此，本課題合成了GRGDSPC肽修飾的PLGA，并制備分別載BMP-2和TGF-β1的殼聚糖微球(CS-MS)，再將載生長因子的CS-MS混入PLGA-pMS中，得到GRGDSPC肽修飾的鑲嵌載生長因子CS-MS的PLGA多孔復(fù)合微球支架(CS-MS-PLGA-pMS)。通過GRGDSPC與細(xì)胞表面整合素受體的識(shí)別作用，改善PLGA-pMS的細(xì)胞親和性，促進(jìn)種子細(xì)胞在支架上的粘附，再通過緩釋BMP

5、-2和TGF-β1促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，以及骨組織的生成。
　　首先，以CS-MS為研究對(duì)象，以合適的粒徑和較高的包封率為目標(biāo)，采用乳化離子交聯(lián)法制備CS-MS，并對(duì)其形態(tài)、粒徑、包封率和體外釋放進(jìn)行考察。通過單因素考察，對(duì)TPP濃度、殼聚糖濃度、殼聚糖分子量、交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間和攪拌速度進(jìn)行了分析，并進(jìn)一步考察了TPP濃度和交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間對(duì)模型藥物白蛋白(BSA)的體外釋放的影響，確定了最優(yōu)的處方條件。以優(yōu)選處方制得了分別載BMP-2和

6、TGF-β1的CS-MS，粒徑分別為15.47±0.53μm和14.78±0.71μm，載藥量為每毫克CS-MS含有1004.27±15.30 ng BMP-2或332.46±44.88 ng TGF-β1，體外緩釋時(shí)間均可達(dá)到9天。
　　結(jié)合W1/O/W2溶劑揮發(fā)法和發(fā)泡法制備了本課題的可注射骨組織工程支架——PLGA-pMS。以PLGA-pMS為研究對(duì)象，以較大的表面孔徑和合適的粒徑為目標(biāo)，進(jìn)行單因素考察，分析了攪拌速度、PL

7、GA濃度、均質(zhì)速度、致孔劑濃度、PVA濃度和O/W1比例對(duì)微球形態(tài)、粒徑和表面孔徑的影響，并確定優(yōu)選處方，得到了粒徑為353.32±35.24μm，表面孔徑為26.30±3.86μm的多孔微球。采用GRGDSPC對(duì)PLGA進(jìn)行改性，先將GRGDSPC-SH與NH2-PEG-Mal連接，得到NH2-PEG-GRGDSPC，再與PLGA-NHS反應(yīng)，合成目標(biāo)產(chǎn)物PLGA-PEG-GRGDSPC。HPLC顯示GRGDSPC和PEG具有極高的反

8、應(yīng)效率（90.60±2.20％）。采用1H-NMR鑒定合成產(chǎn)物后，依照優(yōu)選處方，用PLGA-PEG-GRGDSPC制備PLGA-pMS，并考察MG-63細(xì)胞在多孔微球表面的粘附情況。結(jié)果表明，相比無修飾和PEG修飾的微球，MG-63細(xì)胞在GRGDSPC修飾的PLGA-pMS表面有更廣泛的粘附和更高的細(xì)胞活性。GRGDSPC顯著改善了PLGA-pMS的細(xì)胞親和性，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的PLGA-pMS均采用20％GRGDSPC修飾。
　　在

9、PLGA-pMS制備的初乳中混入CS-MS，得到鑲嵌CS-MS的PLGA-pMS，采用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)和掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)其進(jìn)行了分析和鑒定。在多孔復(fù)合微球支架中，CS-MS被包埋在PLGA中，并保持了圓整的形態(tài)。載藥量分別為每毫克多孔復(fù)合微球支架含有570.27±16.20 ng BMP-2或28.58±5.35 ngTGF-β1。在此基礎(chǔ)上，研究了CS-MS-PLGA-pMS中BSA的體外釋放，進(jìn)而分別分析了BM

10、P-2和TGF-β1的釋放。相比CS-MS，CS-MS-PLGA-pMS中BMP-2和TGF-β1的首日突釋減小，體外緩釋時(shí)間顯著延長，由9天增加至28天。
　　采用密度梯度離心法和貼壁細(xì)胞刪選法，分離和純化了兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到了骨組織修復(fù)所需的種子細(xì)胞。針對(duì)MSCs的多分化潛能和表面標(biāo)志物對(duì)其進(jìn)行分析和鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSCs可在成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，大量表達(dá)具有成骨細(xì)胞特征的堿性磷酸酶;在成脂

11、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，大量表達(dá)具有脂肪細(xì)胞特征的脂滴。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞高表達(dá)CD90，低表達(dá)CD45，符合MSCs的表型特征。細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs。將MSCs與PLGA-pMS共培養(yǎng)時(shí)，MSCs可粘附在多孔微球表面。與未修飾和PEG修飾的微球相比，MSCs在GRGDSPC修飾的PLGA-pMS表面有更廣泛的分布和更高的細(xì)胞活性，表明GRGDSPC顯著改善了PLGA-pMS的細(xì)胞親和性。
　

12、　在得到種子細(xì)胞MSCs和載生長因子的多孔復(fù)合微球支架CS-MS-PLGA-pMS后，以新骨再生為目標(biāo)，考察了裸鼠皮下異位成骨和家兔顱骨缺損修復(fù)這兩個(gè)方面。載BMP-2的支架顯著促進(jìn)了異位骨的形成，其不僅具有更大的重量，而且在骨密度和骨體積等方面顯著優(yōu)于空白組和空白支架。組織切片的HE染色和Masson'strichrome染色結(jié)果顯示，BMP-2-CS-MS-PLGA-pMS形成的異位骨中，新骨分布廣泛，并可觀察到明顯的骨小梁結(jié)構(gòu)?？?/p>

13、白組由于缺乏MSCs依附的載體，新骨生長狀況和質(zhì)量不佳。與空白組和空白支架相比，載TGF-β1的支架顯著提高了異位骨的重量。在設(shè)計(jì)的用量和比例下，聯(lián)用BMP-2和TGF-β1的支架促進(jìn)了新骨的形成，與單用BMP-2相比，兩者形成的異位骨的重量、骨密度和骨體積未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織學(xué)結(jié)果顯示，聯(lián)用BMP-2和TGF-β1的異位骨中有大量尚未完全鈣化但可逐漸發(fā)展為成骨基質(zhì)的類骨質(zhì)。在家兔顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，在兩側(cè)頂骨成功制造了全骨缺損，并將