富含VEGF的殼聚糖微球復合多孔鈦支架治療早期股骨頭壞死的實驗研究.pdf

1、目的：股骨頭壞死是一種骨科常見病，發(fā)病率高，致殘率高，其發(fā)病機制尚不明確，但各種學說的共同點是，不同病因造成的股骨頭血供障礙是股骨頭壞死的主要病理機制。股骨頭壞死的治療重點是早期發(fā)現(xiàn)和早期治療，在股骨頭塌陷之前采取措施改善股骨頭血供，促進骨再生，從而阻止病情進展或逆轉(zhuǎn)病程。因此在股骨頭壞死的修復中，獲得良好的結(jié)構(gòu)支撐和骨組織再生是治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。髓芯減壓術(shù)結(jié)合生物材料植入是最佳方案之一，可以清除壞死組織，延緩股骨頭壞死的進展，促進骨再生

2、。鈦合金具有良好的力學性能和生物相容性，是臨床醫(yī)學領(lǐng)域廣泛使用的材料之一。通過構(gòu)建多孔結(jié)構(gòu)的支架，可以使股骨頭內(nèi)獲得力學支撐，而且整體材料的彈性模量接近人體骨組織，降低應力屏蔽效應，為骨組織再生提供良好的微環(huán)境。VEGF具有強大的促內(nèi)皮增殖、促血管生成、再血管化的作用，在體外可以促使BMSC向成骨方向分化。殼聚糖是一種無毒、生物相容性好、在體內(nèi)可降解的理想的藥物載體。因此，使用3D打印技術(shù)制各多孔鈦支架，再復合以包裹VEGF的殼聚糖微球

3、，然后在體外驗證其促成骨能力，并在兔體內(nèi)驗證其治療股骨頭壞死的效果。
　　方法：首先使用3D打印技術(shù)制備高孔隙率、具有良好生物相容性的多孔鈦支架，再使用離子交聯(lián)法制備包裹VEGF的殼聚糖微球，將二者凍干復合，制得富含VEGF的殼聚糖微球復合多孔鈦支架。在體外檢測支架緩釋VEGF的效果。將支架與BMSC共培養(yǎng)，使用CCK-8法檢測支架對BMSC增殖的影響，使用real-time PCR方法檢測成骨分化相關(guān)基因的表達量，使用ALP染色

4、和茜素紅染色研究細胞ALP的活性和鈣沉積情況。構(gòu)建兔股骨頭壞死模型，將支架植入兔股骨頭內(nèi)，于術(shù)后1個月、2個月和3個月時，對兔的體重、步態(tài)進行評估，使用microCT對兔股骨頭進行影像學評價，使用硬組織切片和Masson三色染色法對股骨頭進行組織學評價，分析骨再生的情況，并與陽性對照組（髓芯減壓術(shù)結(jié)合自體植骨）和模型組進行對比。
　　結(jié)果：1.復合支架制備和緩釋性能研究：成功制備出富含VEGF的殼聚糖微球復合多孔鈦支架。用于細胞培

5、養(yǎng)的支架為圓柱體，直徑為0.9cm，高度為0.5cm;用于動物實驗的支架為圓柱體，直徑為0.3cm，長度為2.5cm。掃描電鏡觀察可見，支架表面被殼聚糖微球覆蓋，微球直徑在30μm左右。ELISA結(jié)果顯示，支架在21天內(nèi)平穩(wěn)釋放VEGF,總釋放量達0.42μg，是總載藥量的84％，顯著高于對照組(p＜0.05)。
　　2.復合支架促進BMSC成骨分化的體外實驗：以BMSC與支架共培養(yǎng)為實驗組，以僅用培養(yǎng)基為對照組。CCK-8實驗結(jié)

6、果顯示，在BMSC培養(yǎng)24小時、48小時，實驗組與對照組的吸光度值相似(0.40±0.05vs0.38±0.04，0.68±0.03vs0.60±0.03，p＞0.05);培養(yǎng)72小時后，實驗組吸光度值高于對照組(1.11±0.08vs0.90±0.01，p＜0.05)。Real-time PCR結(jié)果顯示，培養(yǎng)3天、6天和12天以后，實驗組ALP、BSP、OCN和CollagenⅠ基因表達量均高于同期對照組(p＜0.05)。ALP染色結(jié)

7、果顯示，在培養(yǎng)6天和12天后，實驗組ALP染色的陽性率顯著高于同期對照組染色的陽性率。茜素紅染色結(jié)果顯示，在培養(yǎng)6天和12天后，實驗組鈣結(jié)節(jié)的密度顯著高于同期對照組。
　　3.支架治療兔股骨頭壞死的體內(nèi)實驗：將支架植入兔體內(nèi)后，兔的睡眠、進食未受明顯影響，實驗組步態(tài)較模型組顯著改善，與陽性對照組相似。microCT結(jié)果顯示，實驗組的支架周圍及支架內(nèi)部有骨小梁形成，隨著時間延長，骨小梁量增加，排列趨于規(guī)則;模型組無明顯骨小梁再生;陽

8、性對照組的情況與實驗組類似。定量分析表明，術(shù)后2個月和3個月時，實驗組股骨頭區(qū)的骨量開始明顯高于模型組（0.56±0.06vs0.41±0.003，p＜0.05），和陽性對照組相似（0.56±0.06vs0.57±0.05）。病理切片結(jié)果顯示，實驗組可在支架周圍見骨小梁新生，內(nèi)含豐富的骨陷窩和骨細胞，隨著時間延長，膠原趨于成熟;陽性對照組亦可見到明顯的骨小梁再生，且隨著時間延長，植骨區(qū)的界線逐漸模糊消失;模型組未見明顯的骨再生。