載ADM-PLGA微球的納米羥基磷灰石膠原多孔支架的實驗研究.pdf

1、骨肉瘤是人類在15-20歲這一時期內(nèi)多發(fā)的常見惡性腫瘤。骨肉瘤患者在20世紀70年代之前主要通過手術(shù)進行治療，但是在行手術(shù)切除腫瘤之后患者的生存率不足20％。目前我國作為世界第一人口大國，因骨腫瘤致死或造成殘疾、功能障礙人數(shù)也逐年增多，位居世界各國之首。
　　關(guān)于骨腫瘤的手術(shù)治療，其主要問題不僅在于手術(shù)切除后常常殘存部分未完全切除的腫瘤組織，這是一個復發(fā)的極大隱患，而且還有一個很大的弊端就是在手術(shù)切除腫瘤病灶的同時切除了病灶處的負

2、重骨骼;某些發(fā)生在特定部位的腫瘤，特別是脊柱腫瘤，因為其發(fā)生部位的特殊造成了其常常難以切除，此外，腫瘤組織的跳躍轉(zhuǎn)移以及在手術(shù)中這些組織與正常組織結(jié)構(gòu)的接觸帶來的醫(yī)源性播散，這些都有可能引起手術(shù)后腫瘤的局部復發(fā)。因此，在骨腫瘤切除術(shù)后往往需要進行化療，在臨床上目前使用最廣泛的傳統(tǒng)的化療藥物比如阿霉素、順鉑、長春堿類這些藥物不僅具有抗腫瘤活性，也因為它們起效的非選擇性對人體內(nèi)的各個組織和器官帶來了相應的毒副作用，常規(guī)治療劑量即可對人體產(chǎn)生

3、明顯的骨髓移植、心臟毒性、胃腸道反應等毒副作用，這些毒副作用降低了患者的治療的依從性和生活質(zhì)量，容易引起患者對治療的抗拒，通?；熕幬锞哂袝r間和劑量的依賴，高藥物濃度，較長的半衰期常常可以帶來更好的抗腫瘤效果，但是劑量的提高和用藥時間的延長通常會帶來更加嚴重甚至致命的毒副作用。在漫長的臨床實踐中人們渴望獲得一種可以提高局部藥物濃度，延長藥物作用時間的新的化療藥物來減少化療相關(guān)毒副作用，提高化療效率。隨著制藥技術(shù)的進步，局部緩釋藥物的概念

4、被提出，其思路是緩釋藥物，延長藥物作用時間并且局部靶向給藥，提高藥物的選擇性;而隨著骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，將局部緩釋藥物與仿生的人工骨材料相結(jié)合制備成為在局部植入后可以靶向選擇性給藥并且能夠修復手術(shù)造成的負重骨骼缺損，這種思路為骨腫瘤患者的康復帶來了新的希望。
　　藥物局部緩釋系統(tǒng)在腫瘤的治療方面具有良好的應用前景，這種系統(tǒng)是將一系列具有良好生物相容性、可降解性的無機或有機材料與一種或者是幾種傳統(tǒng)的化療藥物相結(jié)合，通過不同的給藥途

5、徑植入腫瘤切除術(shù)后的原病灶處或者是病灶周圍的組織內(nèi)，由此達到類似于靶向給藥的目的。藥物局部緩釋給藥系統(tǒng)對于局部的殘存的腫瘤細胞、病灶可以作用較長的時間，藥物不需要通過生物代謝，腫瘤細胞在一個較長的時間內(nèi)暴露在較高濃度的化療藥物下，顯著提高了化療藥物的治療效率，同時相對于傳統(tǒng)給藥途徑來說其避免了長時間的全身給藥誘發(fā)的各種毒副反應。晚期癌癥患者或是不能耐受傳統(tǒng)化療的患者，藥物緩釋系統(tǒng)植入可以增大給藥劑量，局部釋放的藥物可對腫瘤長時間的直接起

6、效，這對提高晚期患者的生活質(zhì)量以及延長壽命也有一定的幫助。
　　納米顆粒(nano-particle)有著獨特的表征和理化性質(zhì)，小的尺寸、體積使這類微粒更容易穿透細胞屏障進入組織間隙，顯著的提高了被細胞吞噬的能力，此外納米顆粒還可以增加藥物的穩(wěn)定性和可溶性，同時在改善腎臟的清除率方面可以起到重要作用。在腫瘤組織中的遲滯效應（EPR效應）的基礎(chǔ)上，納米藥物可以選擇性、特異性的通過配體誘導的細胞表面的胞吞作用增加藥物的攝入，在進一步提

7、高療效的同時減少腫瘤的耐藥，通過減少對非目標部位細胞組織器官的損傷，來降低毒性。此外因為納米材料有其獨特的小尺寸、表面或界面效應，納米級別的羥基磷灰石這類材料可以有效地誘導骨組織再生和細胞生長，因此在骨傳導性能上其與傳統(tǒng)的毫米、微米材料相比較具有明顯優(yōu)勢。
　　局部藥物緩釋理念，隨著骨支架修復材料、抗腫瘤藥物的發(fā)展，在納米醫(yī)學的新生土壤之上，有望繼續(xù)發(fā)揮優(yōu)勢，開發(fā)出性能更佳的抗腫瘤納米緩釋包囊和支架材料。我們課題組構(gòu)建了載ADM-

8、PLGA微球的納米羥基磷灰石膠原多孔支架(ADM-PLGA-NHAC)，并對其表征和骨修復能力及抗腫瘤活性進行了相關(guān)檢測。
　　目的:
　　通過制備搭載了阿霉素(ADM)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米緩釋微球的納米羥基磷灰石/膠原多孔支架(ADM-PLGA-NHAC)，并進行相關(guān)實驗檢測這種材料的理化性質(zhì)、釋藥特點以及驗證其體內(nèi)、體外的抗腫瘤能力和骨修復能力，為本材料的臨床實驗打下堅實基礎(chǔ)，為臨床骨肉瘤的治療提供新

9、的思路。
　　方法:
　　1.復乳-溶劑揮發(fā)法加工阿霉素(ADM)-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)緩釋微球;納米羥基磷灰石/膠原多孔支架(NHAC)通過冷凍干燥法以納米羥基磷灰石及膠原為原料進行制備，在NHAC的制備過程中加入ADM-PLGA微球制得載ADM-PLGA納米微球的納米羥基磷灰石/膠原多孔支架(ADM-PLGA-NHAC)。制備完成后材料在體外通過透析袋擴散法及制備浸提液進行材料的藥物釋放動力學實驗和抗腫瘤實

10、驗，再通過掃描電鏡(SEM)、激光粒徑儀等對微球和支架的表征進行相關(guān)測試。
　　2.新西蘭大白兔的臨界骨缺損模型選擇來作為本實驗的動物模型，造模完成后的動物隨機分為3組:A組骨缺損不予處理作為空白對照組;B組骨缺損處以NHAC填塞;C組骨缺損處植入載ADM-PLGA-NHAC。在手術(shù)完成后的第8周及12周處死動物，并對股骨標本行X線檢查，所得X線結(jié)果根據(jù)Lane-Sandhu標準對骨缺損的愈合情況進行評價;X線檢查完成后對各組的骨

11、標本進行Micro-CT掃描，掃描圖像導入電腦進行3維重建，之后再將掃描數(shù)據(jù)導入Micro-CT自帶的分析軟件進行BMD值分析，對骨缺損修復情況進行定量的分析;骨標本行組織學檢測（HE、MASSON染色）及掃描電鏡(SEM)檢測根據(jù)結(jié)果判斷標本的骨修復情況及材料降解情況。
　　3.將MG63細胞接種于裸鼠皮下，成瘤后裸鼠皮下腫瘤以尖刀片隨機植入材料，實驗終止時處死全部裸鼠，腫瘤剝離、稱重并測量腫瘤長、寬計算腫瘤體積。并將腫瘤重量、

12、腫瘤體積進行比較;將裸鼠皮下腫瘤按照標準程序制作石蠟切片（厚度4um），行HE染色觀察腫瘤轉(zhuǎn)移、壞死以及心臟毒性，進行腫瘤組織TUNEL檢測并計算壞死率。
　　4.所有的統(tǒng)計分析均由SPSS13.0軟件完成。具體數(shù)據(jù)均用均值±標準差(X±SD)表示，多組間資料采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用LSD法(least significant difference)，若方差不齊則采用Durnett's T3法

13、進行檢驗;P值＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.本課題組由乳化揮發(fā)法制得的ADM-PLGA納米微球呈圓球形，平均粒徑約為319.5nm±11.17nm，其載藥率為(6.42±0.28)％。制備的ADM-PLGA-NHAC復合支架，其孔徑經(jīng)測試約為100-200um，孔隙率可達到約(82.3±4.6)％，材料多孔而且空洞的內(nèi)壁十分粗糙，有利于細胞黏附及營養(yǎng)交換。釋藥曲線顯示藥物并未出現(xiàn)明顯的突釋現(xiàn)象，24h

14、內(nèi)藥物釋放率約為17.6％，本材料在28d內(nèi)能持續(xù)緩慢釋放ADM，且釋放濃度比較穩(wěn)定。通過活-死染色及CCK8法檢測材料的抗腫瘤效果，結(jié)果顯示ADM-PLGA-NHAC材料的浸提液在體外隨著濃度和時間的增長可以明顯抑制MG63細胞的生長。
　　2.建立新西蘭兔股骨髁骨缺損模型后植入材料，在手術(shù)后的第8周及12周取材進行X線攝片分析、Micro-CT掃描3維重建并進行BMD值分析，結(jié)果顯示:空白對照組骨缺損未愈合而載藥的ADM-PL

15、GA-NHAC支架組與未載藥物的NHAC支架組骨愈合程度無明顯差異。在石蠟切片組織學檢測中顯示A組（空白對照組）未見明顯新骨形成;B組(NHAC組)可見尚未降解的填充材料與散在其間的大量不規(guī)則的新骨組織，新生骨組織開始融合;C組（ADM-PLGA-NHAC組）材料降解程度與B組接近，但不規(guī)則的新骨組織數(shù)量及新生骨組織融合程度差于B組。12周末時A組在骨缺損邊緣處可見少量不規(guī)則新生骨組織，而B組、C組均可見較多的成熟骨組織和骨類似組織融合

16、成片且大量的新生骨質(zhì)與膠原廣泛融合且呈片狀，局部仍可見少量尚未降解的填充材料，兩組均未見明顯炎性細胞浸潤及組織壞死。
　　3.裸鼠處死后以肉眼觀察肺組織有無轉(zhuǎn)移瘤，對剝離干凈的腫瘤進行稱重、測量體積，分別進行HE染色及TUNEL檢測，結(jié)果顯示ADM-PLGA-NHAC組的抑瘤效果最好，各組均肺部無轉(zhuǎn)移，而在腹腔注射阿霉素組裸鼠出現(xiàn)心臟毒性，而其他各組心臟未見明顯異常。
　　結(jié)論:
　　1.我們課題組將納米級別的化療藥物

17、緩釋囊與納米級別的羥基磷灰石相結(jié)合，通過乳化揮發(fā)法、冷凍干燥法研制出了載ADM-PLGA納米囊的納米羥基磷灰石/膠原多孔支架并在體外通過一系列理化檢測證明了其具有良好粒徑、孔隙率、載藥率、緩釋性能及抗腫瘤能力;
　　2.通過建立新西蘭兔股骨髁骨缺損模型并植入我們制備的ADM-PLGA-NHAC材料，在8周后及12周后分別進行X線、Micro-CT以及組織學等檢測，結(jié)果充分證實了載ADM-PLGA納米囊的納米羥基磷灰石/膠原多孔支架